Les mouvements des granules liés aux microtubules

3.2.5.1. Les observations en double marquage

Afin de visualiser directement les interactions entre les GS et le cytosquelette de microtubules en périphérie de la cellule, des cellules BON exprimant à la fois les protéines chimériques tubuline-GFP et NPY-mRFP (cellules BON non clonées, transfection par électroporation) ont ainsi été observées par microscopie TIRF (δ = 200 nm). Les séquences d'images (Vidéo 7) obtenues mettent tout d'abord en évidence la densité relativement importante de microtubules en périphérie de la cellule. Contrairement à l'image classique de la zone juxta-membranaire dans laquelle les microtubules ne pénètrent pas au sein du cortex d'actine (voir Figure 19), il semble ici que l'extrémité de ces microtubules puisse atteindre la membrane plasmique. Nous avons vérifié que ce résultat n'était pas dû à la surexpression de la tubuline-GFP au sein des

cellules. En effet, le marquage des microtubules dans des cellules non transfectées grâce à un anticorps anti-tubuline donne le même type d'images (voir Figure 38A).

Figure 37: Exemple d'un GS se déplaçant le long d'un microtubule. Détail d'une cellule BON exprimant la

tubuline-GFP et la NPY-mRFP. Observations réalisées en microscopie TIRF (δ = 200 nm). Acquisition alternée dans les canaux vert et rouge à une cadence de 4 Hz. La première image obtenue dans le canal vert a ensuite été superposée à la séquence d'images dans le canal rouge. Barre d'échelle: 1 µm.

Les acquisitions en double marquage montrent de plus que la grande majorité des GS présentant une mobilité importante se déplacent le long du réseau de microtubules (Figure 37 et Vidéos 7 et 8). Ces mouvements sur de grandes distances semblent être de nature dirigée. Toutefois, la cadence de prise d'image relativement faible (acquisitions alternées dans les canaux vert et rouge à une cadence de 4 Hz) utilisée lors de ces acquisitions ne permet pas de caractériser ces trajectoires grâce à la méthode d'analyse décrite précédemment.

Afin d'effectuer une telle caractérisation, nous avons modifié le protocole d'acquisition. Utilisant le fait que le réseau de microtubules est relativement stable dans le temps (voir Vidéo 7), nous avons réalisé des acquisitions constituées d'une première observation dans le canal vert (microtubules) suivie par une séquence d'images dans le canal rouge (GS, cadence de 10 Hz durant 30 s). La superposition de l'image du réseau de microtubules à la séquence correspondant aux GS a permis de sélectionner les organites se déplaçant le long de ce réseau. L'analyse des trajectoires décrites par ces organites montre alors qu'environ 90 % d'entre elles sont de nature dirigée (45 GS issus de 8 cellules).

La vitesse de déplacement associée à ces mouvements le long des microtubules a également été mesurée. Elle est égale à 0,64 ± 0,06 µm/s (141 GS issus de 37 cellules), ce qui est très proche de la vitesse de transport associée aux mouvements dirigés déterminée lors de l'analyse globale de la dynamique des GS présents en périphérie de la cellule (voir Tableau 2). L'ensemble de ces observations suggère que la majorité des mouvements de nature dirigée décrits par les GS dans la région juxta-membranaire correspondent à des déplacements le long des microtubules.

3.2.5.2. Analyse de l'effet du nocodazole

Afin de confirmer les résultats obtenus en double marquage, nous avons étudié l'effet du nocodazole, un agent pharmacologique induisant la dépolymérisation des microtubules (Samson, Donoso et al., 1979), sur les mouvements décrits par les GS. Le traitement des cellules BON par cette drogue, utilisée à une concentration de 30 µM, pendant 10 minutes permet un désassemblage important du réseau de microtubules (Figure 38). Il convient toutefois de noter que ce désassemblage n'est pas total. Des traitements sur de plus longues durées permettent une dépolymérisation quasi complète des microtubules mais induisent également un décollement des cellules.

Figure 38: Effet d'un traitement au nocodazole sur le réseau cortical de microtubules. Réseau de

microtubules marqué par un anticorps anti-tubuline dans des cellules BON en conditions témoins (A) ou après 10 minutes de traitement par le nocodazole utilisé à une concentration de 30 µM (B). Observations réalisées en microscopie TIRF (δ = 200 nm). Barre d'échelle: 2 µm.

L'effet du traitement des cellules au nocodazole (clone BC6, traitement à 30 µM pendant 10 min) sur la densité de GS observables en microscopie TIRF (δ = 200 nm) a tout d'abord été déterminé. Il apparaît ainsi qu'un tel traitement induit une diminution de 23 ± 5 % de cette densité (analyse sur 5 cellules, 495 GS avant traitement et 389 GS après). Nous avons ensuite comparé les mouvements décrits par les GS dans ces mêmes cellules avant et après dépolymérisation des microtubules. La proportion de temps passé par ces organites dans chacune des différentes catégories de mouvement a ainsi été calculée (Tableau 7, analyse sur 3 cellules, 251 GS avant traitement et 191 GS après, acquisitions à 10 Hz).

Catégorie ^{Proportion de temps} avant traitement

Proportion de temps

après traitement ^{Variation relative}

Arrêt ou contraint 53 ± 3 % 70 ± 4 % + 32 ± 6 %

Dirigé 5 ± 1% 2 ± 1 % - 53 ± 4 %

Diffusif 42 ± 2 % 28 ± 4 % - 33 ± 8 %

Tableau 7: Proportion de temps passé par les GS dans chaque catégorie de mouvement avant et après un traitement au nocodazole (25 µM, 10 min). L'incertitude sur chaque valeur correspond à l'erreur

standard.

Cette analyse montre donc que la dépolymérisation des microtubules induit non seulement la perte d'une proportion importante des mouvements de nature dirigée mais également d'une partie des mouvements diffusifs. Cette diminution de la proportion de temps passé par les GS dans la catégorie dirigée est en accord avec les résultats obtenus en double marquage montrant que cette catégorie correspond essentiellement à des déplacements le long des microtubules. L'impact du nocodazole sur la classe diffusive, qui semble correspondre principalement à des GS interagissant avec le cortex d'actine, peut être interprété de la façon suivante : en conditions témoins, l'arrivée de GS en périphérie de la cellule par l'intermédiaire des microtubules compense le fait que certains de ces organites se décrochent des filaments d'actine et quittent alors la zone corticale ; en revanche, en présence de nocodazole, cette diminution du nombre de GS piégés dans l'actine ne peut plus être compensée.