Analyse globale des trajectoires des granules de sécrétion en périphérie de la cellule

Afin de caractériser la dynamique des GS en périphérie de la cellule, des cellules BON exprimant de manière stable la protéine chimérique NPY-GFP (clone BC6, voir Matériels et méthodes) ont été observées par microscopie TIRF. La profondeur de pénétration de l'onde évanescente utilisée (δ) était de 200 nm. Les séquences d'images obtenues (acquisition à 10 Hz durant 1 min, pour un exemple, voir Vidéo 1) mettent en évidence la grande variété de dynamiques présentées par les GS. Certains de ces organites sont quasiment immobiles durant toute la séquence tandis que d'autres se déplacent sur plusieurs microns en quelques secondes. Il apparaît également que de nombreux GS semblent changer de comportement au cours de leur déplacement au sein de la zone juxta-membranaire, passant par exemple d'une phase d'arrêt à une phase de mouvement rapide.

A B 0 ^0.1 0.2 -0.2 0 0.2 -0.2 -0.1 0 X (µm) Y (µm) Z ( µ m ) A B 0 ^0.1 0.2 -0.2 0 0.2 -0.2 -0.1 0 X (µm) Y (µm) Z ( µ m )

Figure 26 : Obtention des trajectoires tridimensionnelles. (A) Détermination des trajectoires des GS dans le

plan de focalisation du microscope (x,y) par suivi de particule. Les points noirs marquent le début des trajectoires. Barre d'échelle : 2 µm. (B) Les mouvements selon l'axe orthogonal au plan de focalisation (z) sont déduits de la mesure des variations d'intensité des GS. Il est ainsi possible d'obtenir les trajectoires tridimensionnelles des GS.

Les trajectoires des GS dans le plan de focalisation du microscope (x,y) ont alors été déterminées par une méthode semi-automatique de suivi de particule à l'aide du logiciel Metamorph² (Figure 26A, voir Matériels et méthodes). A partir de la mesure des variations d'intensité de ces organites, leurs déplacements suivant l'axe orthogonal au plan de focalisation (z) ont ensuite été calculés (voir Matériels et méthodes). Les trajectoires tridimensionnelles ainsi obtenues (pour un exemple, voir Figure 26B) ont été analysées grâce à la méthode décrite dans la partie 2. intitulée "Méthode d'analyse des trajectoires complexes". Cette analyse, effectuée sur 528 GS issus de 6 cellules, montre tout d'abord qu'environ la moitié des trajectoires, dont la durée est en moyenne d'une vingtaine de secondes, présentent des changements de comportement. Ce résultat justifie donc le recours à une méthode de caractérisation des mouvements capable de mettre en évidence de tels comportements transitoires. Il indique également que, au moins dans le cas des cellules BON, les GS peuvent passer d'un environnement à un autre ou modifier les interactions qu'ils développent avec cet environnement, relativement fréquemment. Théoriquement, pour des durées de suivi des GS plus longues et avec une résolution temporelle suffisante, de tels changements de comportement devraient pouvoir être observés pour tous les GS et dans tous les types cellulaires.

L'analyse des trajectoires réalisée a aussi permis de déterminer, d'une part, la proportion de temps passé par les GS dans chacune des quatre catégories de mouvements (voir Figure 16) définies pour caractériser leur comportement (Tableau 1) et, d'autre part, les différentes caractéristiques de chacune de ces catégories (Tableau 2).

Catégorie Proportion de temps

Arrêt 9 ± 2 %

Contraint 38 ± 3 %

Dirigé 7 ± 1 %

Diffusif 46 ± 3 %

Tableau 1: Proportion de temps passé par les GS dans chacune des quatre catégories de mouvement.

L'incertitude sur chaque valeur correspond à l'erreur standard.

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Sauf mention contraire, c'est toujours cette méthode qui a été utilisée pour l'obtention des trajectoires des GS lors des analyses présentées dans ce manuscrit de thèse.

Catégorie Caractéristique

Arrêt Durée moyenne 10 ± 1 s

Contraint Durée moyenne 21 ± 1 s

"Rayon" de la cage³, R 65 ± 4 nm

Coefficient de diffusion du GS, DGS 33 ± 5 .10^-4 µm²/s Coefficient de diffusion de la cage, Dcage 2 ± 1 .10^-4 µm²/s

Dirigé Durée moyenne 2,0 ± 0,1 s

Vitesse de transport, v 0.6 ± 0.1 µm/s

Diffusif Durée moyenne 10,4 ± 0,6 s

Coefficient de diffusion, D 24 ± 3 .10^-4 µm²/s

Tableau 2: Caractéristiques des différentes catégories de mouvement. L'incertitude sur chaque valeur

correspond à l'erreur standard.

Cette caractérisation des trajectoires des GS met en évidence différents aspects intéressants de la dynamique de ces organites en périphérie des cellules BON.

i) Tout d'abord, contrairement aux études réalisées précédemment sur des cellules chromaffines d'origine bovine (Oheim and Stuhmer, 2000) ou sur celles de la lignée PC-12 (Steyer and Almers, 1999), les déplacements de nature dirigée sont ici loin d'être négligeables. Ainsi, même si la proportion de temps passé par les GS dans cette catégorie est faible, environ 37 % des trajectoires présentent au moins une période de mouvement dirigé.

ii) Au sujet des périodes d'arrêt, deux arguments indiquent que cette catégorie peut sans doute être englobée dans celle regroupant les mouvements de nature contrainte. D'une part, le coefficient de diffusion de la cage dans le cas des mouvements contraints (D_cage=2.10^-4µm²/s) est proche de celui utilisé pour définir les périodes d'arrêt (D_min =1.10^-4µm²/s, voir la partie consacrée à la méthode d'analyse des trajectoires). Ceci suggère que ces périodes d'arrêt correspondent en fait à un mouvement restreint à l'intérieur d'une cage dont la taille est inférieure à la résolution spatiale de la méthode de suivi de particule utilisée. Dans ce cas, en effet, seuls les déplacements de la cage sont détectables. Sachant que l'incertitude sur la position des GS est d'environ 16 nm (quasi identique suivant x,

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Le rayon de la cage correspond à l'espace disponible autour du GS piégé dans cette cage ou à la longueur du lien retenant cet organite.

y ou z, voir Matériels et méthodes), le "rayon" de ces cages serait inférieur à 3*16≈30nm. D'autre part, l'analyse des trajectoires des GS a mis en évidence l'existence de périodes fixes au sein de zones classées comme contraintes (ces zones ont alors été considérées comme globalement contraintes). Une telle observation, qui n'est pas surprenante étant donnée la faible différence entre Dcage et Dmin, renforce l'idée selon laquelle les catégories associées aux périodes d'arrêt et aux mouvements contraints peuvent être regroupées.

La proportion de temps passé par les GS dans des cages dont la taille est proche de celle de ces organites est alors égale à 9 + 38 = 47%. Les mouvements des GS dans la zone juxta-membranaire sont donc en général très restreints ce qui est en accord avec les études réalisées précédemment sur d'autres modèles cellulaires (Steyer and Almers, 1999 ; Johns, Levitan et al., 2001 ; Manneville, Etienne-Manneville et al., 2003). Il est de plus intéressant de noter que la taille des cages mesurée dans le cas des cellules BON est proche de celles obtenues à partir de l'analyse des trajectoires décrites par les GS dans des cellules chromaffines d'origine bovine (Steyer and Almers, 1999 ; Johns, Levitan et al., 2001).

La région juxta-membranaire possède une architecture "anisotrope". Ainsi, alors que cette architecture évolue très rapidement suivant la direction z (passage du réseau de microtubules au cortex d'actine puis à la membrane plasmique en quelques centaines de nanomètres), elle est relativement homogène dans le plan (x,y). Il apparaissait donc intéressant d'analyser si une telle anisotropie avait des répercussions sur les mouvements des GS. Nous avons pour cela comparé les coefficients de diffusion moyens des GS (i.e. calculés pour les trajectoires entières, voir Matériels et méthodes) selon l'axe z (Dz) et dans le plan (x,y) (Dxy).

En moyenne, Dxy / Dz = 6,4 ± 1,2 (528 GS issus de 6 cellules). Il semble donc que les GS soient nettement plus mobiles dans le plan (x,y) que suivant l'axe z. Une analyse plus détaillée montre cependant que ce sont essentiellement les GS présentant des périodes de mouvement dirigé sur de grandes distances qui sont caractérisés par un rapport Dxy / Dz élevé. Ceci suggère qu'au voisinage de la membrane, les mouvements de nature dirigée se déroulent préférentiellement dans le plan (x,y). L'interprétation de ce résultat est cependant délicate. En effet, les GS se déplaçant rapidement suivant l'axe z sont difficilement détectables par microscopie TIRF car ils passent des temps très courts au sein du champ d'évanescence. Il est donc possible que l'anisotropie observée pour les mouvements dirigés soit due au biais induit par les observations en TIRF.

Pour les GS ne décrivant pas de périodes dirigées, Dxy / Dz = 2,5 ± 0,2. Par conséquent, une certaine anisotropie entre les mouvements dans le plan (x,y) et suivant l'axe z est toujours observable. Les GS considérés ici présentant des mouvements faibles (généralement inférieurs à un diamètre de GS, i.e. 200-250 nm), cette anisotropie n'est probablement pas un artéfact associé aux observations par microscopie TIRF. A titre de comparaison, pour une bille de 200 nm plongée dans un milieu homogène et localisée à environ 100 nm d'une interface plane,

Dxy / Dz ≈ 3 (Banerjee and Kihm, 2005). Il est donc possible que la mobilité plus importante des GS dans le plan (x,y) par rapport à celle mesurée suivant l'axe z soit simplement le reflet de leur proximité avec la membrane plasmique. Cette anisotropie des mouvements décrits par ces GS pourrait aussi être la conséquence de l'accrochage à la membrane plasmique d'une partie d'entre eux. En effet, si cet accrochage implique un blocage des mouvements des GS suivant l'axe z, en revanche, ces organites peuvent continuer à se déplacer dans le plan (x,y) dans le cas où le lien qui les fixe à la membrane peut diffuser au sein de cette membrane.