Le système de régulation par la tétracycline

Le système de régulation par la tétracycline développé par Gossen et Bujard en 1992 dérive de l’opéron de résistance à la tétracycline du transposon Tn10 d’Escherichia coli (Gossen and Bujard, 1992). Chez la bactérie, la résistance est assurée par une protéine dont l’expression est induite par la tétracycline. Celle-ci ou son analogue, la doxycycline (Dox), induit un changement conformationnel de la protéine répresseur de la transcription (TetR), ce qui conduit à la dissociation des séquences opérateurs (TetO). Par contre, en absence de tétracycline, TetR se dimérize et se lie sur TetO.

Pour créer le système de régulation, Gossen et Bujard ont mis à profit la capacité du Tet R à se lier au TetO en absence de tétracycline. Pour ce faire, ils ont remplacé le domaine d’activation de la transcription de TetR par le domaine d’activation de la transcription VP16 du virus HSV pour générer une protéine transactivatrice artificielle tTA (tetracycline Transactivator). Sept copies de la séquence de TetO ont été placées en amont d’un promoteur minimal CMV. Ainsi, en absence de tétracycline, la protéine de fusion tTA se fixe sur TetO et active la transcription. En revanche, en présence de tétracycline, la tTA subit un changement de conformation qui empêche sa fixation sur TetO et inactive ainsi la transcription (Gossen and Bujard, 1992) (figure 19a). Ce système appelé “Tet-off”, a permis une induction de l’expression d’un gène rapporteur d’un facteur 105 dans des cellules HeLa

exprimant de façon stable tTA en l’absence de tétracycline dans le milieu de culture (Gossen and Bujard, 1992). Chez des souris transgéniques exprimant la luciférase ou la β-galactosidase sous contrôle du système “Tet-off”, l’arrêt de l’apport en doxycycline a permis d’augmenter jusqu’à 5000 fois le taux d’expression du gène considéré (Furth et al., 1994). Ce système a également été utilisé in vivo pour réguler l’expression de l’EPO (Bohl et al., 1997), d’immunoglobulines (Perez et al., 2004) ou encore de la tyrosine hydroxylase dans le cerveau (Corti et al., 1999b; Corti et al., 1999a). Afin de réduire les interactions possibles entre tTA et des facteurs cellulaires endogènes, le domaine d’activation VP16 du tTA a été amputé de 12 acides aminés. Ces modifications ont permis de créer un nouveau transactivateur tTA mieux toléré à une forte concentration intracellulaire (Baron et al., 1997).

Le système « Tet-off » implique un apport continu de l’antibiotique pour inhiber l’expression du gène d’intérêt, ce qui risque d’entraîner la nécessité de traitement assez long avec l’antibiotique. Partant de ce constat, l’équipe d’Hermann Bujard a identifié un mutant de TetR ayant un phénotype inverse, qui se fixe sur TetO en présence de tétracycline. Ce nouveau transactivateur nommé rtTA (reverse tetracycline Transactivator) possède quatre acides aminés mutés dans TetR. Par analogie à “Tet-off”, ce système a été nommé “Tet-on” (Gossen et al., 1995) (figure19b).

L’activation du système Tet-on s’est révélée plus rapide que celle du système Tet-off, qui dépend de l’élimination de la doxycycline. En effet, un facteur d’induction supérieur à 1000 a été observé dans des cellules HeLa exprimant le rtTA de façon constitutive en présence de doxycycline dans le milieu de culture. De même, chez des souris transgéniques exprimant le gène rapporteur luciférase sous contrôle du système “Tet-on”, l’apport de doxycycline a permis d’induire l’expression du transgène d’un facteur supérieur à 105 (Kistner et al., 1996). Toutefois, le système Tet-on est moins sensible à l’inducteur que le système Tet-off, ce qui soulève la question de la concentration minimale de doxycycline nécessaire pour induire le système Tet-on de façon efficace in vivo. Cependant, cette faible sensibilité du rtTA à la doxycycline peut devenir un avantage et peut être exploité pour permettre une régulation différentielle de deux gènes différents avec deux concentrations d’antibiotiques différentes. Ainsi, les deux transactivateurs tTA et rtTA ont été utilisés pour moduler indépendamment l’expression de deux gènes rapporteurs. Ceux-ci peuvent être maintenus

dans un état de pré-activation à une concentration intermédiaire de doxycycline (Baron et al., 1999). Plus récemment, une approche par évolution virale a permis d’isoler des variants de rtTA qui, en présence de doxycycline, sont 25 fois plus sensibles et 5 fois plus actifs que le rtTA original sans affecter l’activité basale en absence de l’inducteur (Das et al., 2004).

En plus de la faible sensibilité à l’inducteur, le système Tet-on présente une activité résiduelle due à une affinité du rtTA au TetO en absence de doxycycline. Pour remédier à cette fuite d’expression en absence de l’inducteur, des mutations aléatoires sur le transactivateur tTA ont été effectuées. Cette stratégie a permis d’isoler deux nouveaux transactivateurs dénommés rtTA2-S2 et rtTA2-M2 qui possèdent une meilleure sensibilité à l’inducteur et une activité basale réduite en absence de doxycycline (Urlinger et al., 2000). rtTA2-S2 présente un niveau basal plus faible que rtTA2-M2, mais ce dernier présente néanmoins l’avantage d’être environ 10 fois plus sensible à la doxycycline. (Urlinger et al., 2000; Lamartina et al., 2002). Ces nouveaux transactivateurs ont été utilisés avec succès in

vivo pour contrôler l’expression de nombreux transgènes après transfert dans différents

tissus, et avec une grande variété de vecteurs (Aurisicchio et al., 2001; Lamartina et al., 2002; Salucci et al., 2002; Koponen et al., 2003). Toutefois, malgré les améliorations apportées, ces nouveaux transactivateurs présentent toujours une fuite d’expression importante en absence d’inducteur. Pour réduire la fixation du rtTA sur les TetO en absence d’inducteur, un répresseur de la transcription ou “silencer” tTS (tetracycline Transcriptionnal Silencer), également dépendant de la tétracycline, a été utilisé (Freundlieb et al., 1999). En absence de doxycycline, tTS se fixe sur TetO à la place du rtTA, ce qui inhibe efficacement la transcription. En revanche, en présence de doxycycline, cette répression est levée, ce qui entraîne la fixation de rtTA et induit la transcription. Le tTS est une protéine de fusion entre le domaine répresseur de KRAB (Kruppel-Associated Box) de la protéine humaine Kid-1 et le domaine de fixation à l’ADN de TetR. Plusieurs études ont montré que la combinaison du système rtTA avec tTS permet de réduire l’expression basale d’un gène in vivo (Zhu et al., 2001; Salucci et al., 2002; Lamartina et al., 2003; Mizuguchi et al., 2003). Pour optimiser l’apport de ce système activation /répression, tous les composants ont été introduits dans un seul vecteur adénoviral et évalués in vitro et in vivo (Salucci et al., 2002; Mizuguchi et al., 2003; Rubinchik et al., 2005; Xiong et al., 2006). Toutefois, il a été montré que l’inclusion de tTS induisait une diminution de l’activation du

transgène (Lamartina et al., 2003), et que cette activation était progressivement perdue dans des cellules CHO transduites avec un vecteur lentiviral exprimant à la fois rtTA2-M2 et tTSKid (Barde et al., 2006). Une faible activité basale et un fort taux d’induction ont toutefois été observés dans cette étude (Barde et al., 2006).

Une approche différente pour contrôler l’expression de rtTA et de ce fait l’expression du transgène en absence d’inducteur, consiste à placer l’expression du rtTA sous “autorégulation” (Chtarto et al., 2003). Cette stratégie a permis in vitro une expression basale faible et un niveau d’expression du gène d’intérêt supérieur à celui obtenu avec un promoteur CMV (Markusic et al., 2005).

Les systèmes de régulation par la tétracycline se sont illustrés avec succès dans leurs capacités à contrôler efficacement un gène d’intérêt in vitro et in vivo, ce qui fait d’eux aujourd’hui des outils de choix pour la régulation de l’expression de gènes dans des cellules de mammifères. Partant de ce constat, nous avons utilisé le système “Tet-on“ dans le cadre de notre étude.