Alternatives au système tétracycline

II.1. Système de régulation par la rapamycine

L’utilisation clinique de systèmes de régulation et en particulier du système tétracycline nécessitera des études complémentaires afin d’évaluer la réponse immunitaire dirigée contre la protéine transactivatrice en fonction de la dose et du type de vecteur utilisé. Pour s’affranchir d’une éventuelle réponse immunitaire chez l’homme du système tétracycline, une possibilité serait d’utiliser des systèmes de régulations d’origine humaine comme le système de régulation par la rapamycine (Rivera et al., 1996). Récemment une étude menée chez le singe rhésus n’a montré aucune réponse immunitaire apparente après l’injection intramusculaire d’un vecteur AAV qui permet l’expression régulée d’EPO par le système rapamycine (Rivera et al., 2005). Le système de régulation par la rapamycine peut être une approche prometteuse pour l’expression régulée d’une protéine thérapeutique en thérapie génique. Egalement, le développement de systèmes de régulation basés sur la technologie des protéines en doigt de zinc peut être une autre approche pour une thérapie génique sûre et efficace.

II.2. Régulation physiologique

De nombreux systèmes de régulation nécessitent l’utilisation d’un transactivateur chimérique qui peut entraîner une réponse immunitaire. Une approche alternative serait de

placer le transgène d’intérêt sous contrôle d’éléments de régulation physiologiques (Miller and Whelan, 1997; Varley and Munford, 1998). En effet, une régulation endogène de protéine thérapeutique a été permise à partir d’un promoteur induit par des stimuli inflammatoires (Varley and Munford, 1998). Ces promoteurs ont été intégrés au sein de vecteurs viraux. Une expression régulée du facteur thérapeutique a été observée in vivo en fonction de l’état inflammatoire des animaux (Miagkov et al., 2002; van de Loo et al., 2004). Une régulation physiologique est également envisagée pour le traitement du diabète. Dans ce contexte, des promoteurs dont l’activité est régulée par les taux de glucose sont utilisés pour contrôler la synthèse de gènes thérapeutiques comme ceux codant pour l’insuline, le VIP (Vasoactive Intestinal Peptide), ou des facteurs immunosuppresseurs (Varley and Munford, 1998). Une étude récente a montré la capacité du promoteur à contrôler l’expression de différents transgènes dans le SNC en réponse à une lésion cytotoxique (Jakobsson et al., 2006). Des vecteurs lentiviraux exprimant soit la béta-galactosidase sous le contrôle du promoteur GFAP, soit la GFP sous contrôle du promoteur de l’enképhaline ont été injectés dans le striatum de rats lésés à la 6-OHDA, ou à l’acide iboténique (Jakobsson et al., 2006). La GFAP est une protéine des filaments intermédiaires qui est surexprimée lors de la réactivité gliale qui a lieu après la lésion. L’expression de l’enképhaline est augmentée après la déplétion en dopamine induite par la liaison à la 6-OHDA. L’expression de la beta-galactosidase et de la GFP est induite dans les astrocytes et dans les neurones respectivement, dans le cerveau des rats lésés. L’expression des transgènes augmente en fonction de la sévérité de la lésion.

Cette approche de régulation dépendante d’un état pathologique permet un contrôle du transgène sans l’apport de molécule inductrice et sans l’expression d’un transactivateur, ce qui devrait permettre d’éviter une réponse immunitaire. L’application thérapeutique d’un système de régulation dépendant d’un état physiologique nécessite encore des développements, mais l’accroissement de nos connaissances sur la physiopathologie des maladies et la disponibilité d’éléments de réponses répondant à des stimuli propres aux conditions pathologiques permettra un jour l’utilisation de ce type de système de régulation chez l’homme.

II.3. Régulation par les protéines en doigt de zinc

La disponibilité de méthodes rapides et robustes pour contrôler l’expression des gènes est primordiale pour l’étude de la fonction de ces gènes, mais également pour des interventions thérapeutiques. Cette dernière approche devient possible grâce à l’utilisation des protéines en doigt de zinc (ZFP, zinc-finger proteins). Les ZFP sont des facteurs de transcription qui possèdent deux domaines fonctionnels : un domaine de liaison à l’ADN et un domaine effecteur (activateur ou répresseur) qui agit sur la transcription. Ce type de protéine comporte des éléments répétés avec une forme de doigts de gant. Il existe plusieurs types de ZFP, caractérisés par leur motif de liaison à l’ADN. Les ZFP à motif Cys2-His2 représentent les protéines les plus communes chez les eukaryotes (Beerli and Barbas, 2002). Chaque doigt de zinc reconnaît précisément 3 paires de bases consécutives. En utilisant deux protéines comportant chacune trois doigts de zinc pouvant être individuellement choisis, la reconnaissance s’effectue sur une séquence spécifique de 18 nucléotides. Cette méthode permet ainsi de cibler de manière spécifique et unique une séquence d’intérêt connue. Le domaine en doigt de zinc Cys2-His2 est particulièrement intéressant pour la construction de facteurs de transcription synthétiques. Alors que les domaines de liaison à l’ADN de nombreuses protéines se lient comme des dimères et utilisent des domaines de reconnaissance non modulables, la modification à la fois de la structure et de la fonction des domaines de liaison des ZFP font de ces dernières des outils de choix pour contrôler la fonction de gènes (Beerli and Barbas, 2002).

Il existe actuellement trois méthodes qui peuvent être utilisées pour affecter l’expression de gènes en utilisant la technologie ZFP. La première consiste à bloquer la transcription d’un gène par la surexpression d’une protéine ZFP chimèrique qui, en se fixant de façon spécifique sur la séquence codante du gène à inhiber, va provoquer une gêne stérique et empécher la transcription (Choo et al., 1994). La deuxième statégie est également basée sur une gêne stérique mais il s’agira cette fois-ci de cibler le promoteur pour empêcher la fixation des protéines d’initiation de la transcription (Kim and Pabo, 1997). Enfin, la troisième stratégie repose sur la fusion de domaines de régulation de la transcription avec le domaine de liaison à l’ADN des ZFP (Pomerantz et al., 1995; Choo et al., 1997; Beerli et al., 2000a). Cette dernière stratégie a été utilisée avec succès pour générer des régulateurs

d’expression de gènes, qui peuvent être utilisés comme des activateurs ou des inhibiteurs en fonction du domaine effecteur utilisé.

Le développement de protéines ZFP chimériques, qui se lient à des séquences spécifiques de l’ADN, facilite les stratégies de manipulation de l’expression de gènes à la fois dans les cultures de cellules et dans les organismes entiers. Toutefois, une régulation constitutive d’un gène cible n’est pas désirable à long terme. Pour toute application thérapeutique, une régulation réversible par l’apport d’une molécule inductrice est préférable et ceci afin de limiter les effets secondaires et d’augmenter la sécurité. Plusieurs systèmes de régulations ont été décris (voir plus haut). Ainsi, la fusion des domaines de liaison à l’ADN des ZFP avec les domaines régulateurs de la transcription a permis d’obtenir des protéines modulatrices de la transcription en fonction de l’apport d’une molécule inductrice (Beerli et al., 2000b; Xu et al., 2001b). En effet, la fusion du domaine de liaison du ligand du recepteur aux œstrogènes et du domaine d’activation de la transcription VP16 avec le domaine de liaison à l’ADN de ZFP a permis de contrôler avec succès l’expression de la luciférase (Xu et al., 2001b).

Les composants des systèmes de régulation en vue d’une application clinique ne doivent pas entraîner de réponses immunitaires et dans ce cadre, des composants humains (système rapamycine ou protéine ZFP) doivent être utilisés. De plus, l’utilisation d’un système qui peut être contrôlé par un inducteur exogène est un élement important. Cependant, des développements supplémentaires seront nécessaires. A terme, le clinicien pourra doser la quantité de molécules thérapeutiques (protéine ou shARN) en fonction des besoins de chaque patient et arrêter le traitement en cas de complication grave.