Développement d’un système de régulation de l’expression de petits ARN interférents : construction d’un vecteur lentiviral pour le

contrôle d’un gène endogène par ARN interférence.

Article 2 :

Control of small inhibitory RNA levels and RNA interference by doxycycline induced activation of a minimal RNA polymerase III promoter.

Lahouari Amar, Mathieu Desclaux, Nicole Faucon-Biguet, Jacques Mallet and

Roland Vogel

Nucleic Acids Research, 2006

En 2001, l’équipe de Thomas Tuschl a mis en évidence la possibilité de déclencher dans des cellules de mammifère le mécanisme de l’ARNi par transfection de petits ARN double brin chimiquement synthétisés, les siARN (Elbashir et al., 2001b). La limite majeure de cette étude est l’inhibition transitoire de l’expression d’un gène. Une inhibition à plus long terme peut être obtenue par la synthèse endogène de shARN par un vecteur plasmidique (Brummelkamp et al., 2002; Paddison et al., 2002) ou par un vecteur viral (Abbas-Terki et al., 2002; Barton and Medzhitov, 2002; Qin et al., 2003; Tiscornia et al., 2003). Une fois introduits dans la cellule, ces shARN sont rapidement clivés en siARN in

situ. Toutefois, l’inhibition constitutive d’un gène n’est pas adaptée à l’étude de la survie

cellulaire, de la régulation du cycle cellulaire ou du développement. De telles études nécessitent une inhibition conditionnelle de l’expression d’un gène ciblé. L’inhibition conditionnelle d’un gène peut également se révéler particulièrement importante pour une application thérapeutique, car elle permet de contrôler l’expression des shARN par une molécule inductrice. Le traitement peut ainsi être adapté aux besoins du patient, ou arrêté en cas de complications graves. Dans ce contexte, nous avons développé un système inductible d’expression des shARN qui repose sur le système “Tet-on” et ne requiert l’utilisation que d’un seul vecteur viral.

La présence d’une extrémité poly(A) empêche l’effet inhibiteur des siARN (Xia et al., 2002). Les shARN doivent par conséquent être exprimés par l’ARN polymérase III qui permet la synthèse d’ARN d’une taille réduite, puisque cinq résidus Thymidines consécutifs suffisent pour arrêter la transcription. Au cours de cette étude nous avons utilisé le promoteur U6.

La boite TATA et l’ESP du promoteur U6 sont reconnus par les facteurs de démarrage de la transcription. L’ESD de ce promoteur interagit avec les facteurs de transcription STAF1 et Oct1, qui activent la machinerie transcriptionnelle (Schramm and Hernandez, 2002). La délétion de l’ESD réduit drastiquement l’efficacité de la transcription (Danzeiser et al., 1993). Cet élément est par conséquent déterminant pour l’activation de la transcription. Toutefois, il est possible de réactiver un promoteur U6 dépourvu de l’ESD lorsque cet élément est remplacé par plusieurs sites de liaison du transactivateur GAL4 de levure. La transcription est alors induite par un transactivateur qui contient le domaine de liaison à l’ADN de GAL4 fusionné avec différents domaines transactivateurs (Das et al., 1995). L’utilisation en quatre copies identiques d’une partie du domaine transactivateur du facteur de transcription Oct2 dans lequel tous les résidus glutamines sont mutés en alanine ((Oct-2(4xQ18Q→A)) a permis la réactivation transcriptionnelle du promoteur U6. De plus, ces mutations assurent l’activation spécifique du promoteur U6 (Das et al., 1995).

En nous basant sur ces résultats, nous avons développé une stratégie nouvelle, qui découle de la stratégie décrite ci-dessus. Nous avons utilisé un facteur de transcription chimérique qui comprend le domaine de liaison à l’ADN de rtTA (Urlinger et al., 2000) fusionné avec le domaine d’activation de la protéine mutée Oct2 (Oct-2(4xQ18Q→A) (Figure 1A). Nous avons remplacé au sein du promoteur U6 humain l’ESD par sept TetO (figure 1B). Les cassettes d’expression des shARNs et du transactivateur rtTA-Oct2 ont été intégrées dans le même vecteur lentiviral (figure 2A).

Dans une première étape de notre travail, nous avons évalué la capacité de notre système à contrôler l’expression de la GFP dans une lignée 293T exprimant de façon stable cette protéine (293T-GFP). En présence de doxycycline le transactivateur se lie sur les séquences TetO et doit ainsi activer la transcription (figure 1D). Inversement, en l’absence

de doxycycline, le transactivateur ne peut se lier aux séquences TetO et par conséquent aucun effet ARNi ne doit être détecté (figure 1C). Nous avons transduit les cellules 293T-GFP avec le vecteur lentiviral permettant la synthèse régulée de sh293T-GFPs. L’analyse par “northern blot” montre une expression de shGFP dans les cellules transduites et cultivées en présence de doxycycline (figure 2B). En revanche, en absence de l’inducteur, aucun signal au-dessus de seuil de détection n’a été détecté dans les cellules transduites. L’expression de la GFP a été analysée par FACS, avant et après induction par la doxycycline. L’incubation des cellules transduites en présence de doxycycline conduit à une inhibition importante de l’expression de la GFP (figure 3A). La diminution du nombre de cellules GFP positives est corrélée avec la quantité de vecteur viral utilisé pendant la transduction (figure 2C). Nous avons caractérisé l’efficacité de ce système en utilisant un clone cellulaire. Nous avons évalué le temps et la dose de doxycycline nécessaires pour obtenir une induction maximale de l’ARNi. Une réduction significative de l’expression de la GFP a été observée après un jour de traitement et une diminution de plus de 90% a été mesurée après quatre jours de traitement (figure 3B). La concentration de doxycycline nécessaire pour l’induction maximale de shARNs a été évaluée par des expériences de dose-réponses. Une inhibition de plus de 90% a été observée en présence de 6 µg/ml de doxycycline (figure 3C). L’arrêt du traitement a conduit au retour au niveau basal de l’expression de la GFP après 4 jours (figure 3D). Ce résultat montre la réversibilité de ce système de régulation.

La deuxième partie de ce travail a consisté à évaluer la capacité de ce système de régulation à contrôler l’expression d’un gène endogène. Nous avons choisi le gène p53 comme gène endogène car sa détection est aisée et un shARN efficace a été précédemment décrit (Brummelkamp et al., 2002). Nous avons construit un second vecteur qui contient un shARN dirigé contre la p53 humaine. Des cellules 293T, MCF-7 et A549 ont été transduites avec différentes quantités de vecteur et incubées en présence ou en absence de 6 µg/ml de Dox. Les analyses par « western blot » ont montré une inhibition de plus de 90% de la protéine p53 en présence de 6 µg/ml de doxycycline, alors qu’aucune diminution significative n’a été mesurée en absence de doxycycline (figure 4). Ces résultats montrent l’efficacité de ce système à réguler l’expression d’une protéine endogène.

En conclusion, nous avons développé un système de régulation qui permet une expression contrôlée par la doxycycline de shARN et démontré son inductibilité, sa réversibilité et sa stabilité dans le déclenchement de l’ARNi dans des cellules de mammifères.

Dans ce travail, nous avons développé des vecteurs lentiviraux permettant l’expression régulée de facteurs thérapeutiques de nature protéiques ou nucléotidiques. Cette régulation est basée sur l’utilisation de la dernière version du système Tet-on, qui repose sur le transactivateur rtTA2-M2.

Ce travail a été effectué suivant deux axes. Le premier a porté sur le développement d’un vecteur lentiviral unique capable d’exprimer à la fois les cassettes d’expression du transgène et du transactivateur. La deuxième partie de ce travail a consisté au développement d’un nouveau système de régulation de l’ARN interférence et à son introduction dans un seul vecteur lentiviral.