ASSEMBLAGE DU PORE DE TRANSLOCATION
B. Photographie en négatif de l’image d’un pore numérisé avec le logiciel Samba Technologies IPS.
4- LcrV, protéine d’assemblage du pore de translocation YopB/D
J’ai pu observer que des anticorps polyclonaux purifiés, dirigés spécifiquement contre la protéine recombinante LcrV de Y. pestis, protègent les hématies de la lyse induite par le SSTT de P. aeruginosa. Ainsi, en collaboration avec Petr Broz, doctorant dans le laboratoire du Pr. G. Cornelis, nous avons étudié la composition et l’assemblage du pore de translocation du SSTT de Y. enterocolitica puis testé le pouvoir protecteur des anticorps anti-LcrV contre les infections à Yersinia spp.
Dans un premier temps, nous avons testé l’activité hémolytique de plusieurs souches de Y. enterocolitica dans notre test d’hémolyse (figure V.5). Les conditions choisies pour le test d’hémolyse avec Y. enterocolitica sont identiques à celles utilisées avec P. aeruginosa. Comme l’ont rapporté les travaux de plusieurs auteurs (Marenne et al., 2003; Neyt et Cornelis, 1999a), on observe que la souche sauvage E40 de Y. enterocolitica est non hémolytique alors que la souche poly-mutante DHOPEMN, défective pour les effecteurs YopH, YopO, YopP, YopE et YopM ainsi que pour la protéine régulant la sécrétion YopN (Forsberg et al., 1991), induit la lyse d’environ 60% des hématies (figure V.5). Contrairement
à la souche sauvage, ce mutant DHOPEMN provoque également la lyse de macrophages, via la formation de pores probablement composés par les protéines translocatrices YopB et YopD (Marenne et al., 2003; Neyt et Cornelis, 1999a). Il a été montré que la délétion de lcrV affecte la sécrétion des protéines YopB et YopD (Lee et al., 2000; Marenne et al., 2003). Néanmoins, la délétion de yopQ supprime l’effet de la délétion de lcrV sur la sécrétion des protéines translocatrices. En effet, il a été montré que la souche DHOPEMNVQ produit et sécrète des quantités similaires de YopB et YopD à la souche sauvage (Marenne et al., 2003). Toutefois, la souche DHOPEMNVQ, comme les souches mutantes DHOPEMNB et DHOPEMND, n’est pas hémolytique (Figure V.5) (Marenne et al., 2003). L’activité hémolytique de la souche DHOPEMN requiert donc l’expression des trois protéines LcrV, YopB et YopD (figure V.5) (Marenne et al., 2003; Neyt et Cornelis, 1999a).
Figure V.5. Activité hémolytique SSTT-dépendante de Y. enterocolitica.
Les GRM sont infectés par la souche sauvage de Y. enterocolitica (wt E40) et par les quatre autres souches mutantes DHOPEMN, DHOPEMNB, DHOPEMNV et DHOPEMNVQ, à une MOI de 1.
L’activité hémolytique dépendante du SSTT de Y. enterocolitica est donc suffisamment significative pour utiliser les GRM comme modèle cellulaire afin d’étudier la présence des protéines LcrV, YopB et YopD dans les membranes de cellules eucaryotes infectées par Y. enterocolitica ainsi que la fonction de LcrV dans la formation du pore de translocation YopB/D.
Ainsi, les protéines LcrV, YopB et YopD ont été recherchées par Western blot dans les membranes isolées d’hématies infectées par la souche sauvage E40 de Y. enterocolitica ou par les mutants DHOPEMN, DHOPEMNB, DHOPEMND, DHOPEMNV et DHOPEMNVQ (figure V.6). Ces expériences ont été principalement réalisées par Petr Broz à Grenoble et à Bâle. Sur la figure V.6, on peut voir que seules les protéines translocatrices, YopB et YopD, sont retrouvées en quantité significative dans les membranes de GRM infectés par le mutant hémolytique DHOPEMN. Ces deux protéines constituent donc le coeur membranaire, du pore de translocation inséré dans la membrane cytoplasmique des cellules eucaryotes,
L’analyse des membranes de GRM infectés par le mutant D HOPEMNB ou DHOPEMND montre que l’absence de YopB n’affecte pas l’insertion de YopD dans les membranes d’hématies, et inversement l’insertion de YopB ne requiert pas la protéine YopD (figure V.6).
L’antigène V de Y. enterocolitica (LcrV), qui est essentielle à l’activité formatrice de pore, n’est jamais retrouvé associé aux membranes de GRM (figure V.6). Cependant, en absence de cet antigène, mutant DHOPEMNVQ, très peu de protéines YopB sont détectées dans les membranes de GRM alors que la quantité de YopD est similaire à celle retrouvée dans les membranes d’hématies infectées par la souche DHOPEMN. La protéine LcrV est donc nécessaire à l’insertion et/ou à la stabilisation de YopB dans les membranes des GRM. Ces résultats indiquent que l’antigène V de Y. enterocolitica, comme celui de P. aeruginosa, intervient dans l’assemblage des pores de translocation YopB/D fonctionnels dans la membrane cytoplasmique des cellules eucaryotes.
Figure V.6. Insertion des protéines YopB et YopD dans les membranes d’hématies infectées par Y. enterocolitica.
Les GRM ont été infectés par les différentes souches de Y. enterocolitica indiquées sur la figure, à une MOI de 1 pendant 1 h à 37°C. Les membranes infectées de GRM ont été isolées par flottaison sur un gradient de saccharose discontinu, puis concentrées par ultracentrifugation. Les protéines présentes dans le culot membranaire ont été séparées par SDS-PAGE puis analysées en Western blot à l’aide des anticorps polyclonaux purifiés de souris anti-LcrV (1/1000ème), du sérum polyclonal anti-YopB (1/1000ème) et des anticorps
monoclonaux de rat anti-YopD (1/1000ème).
Contrairement aux membranes infectés par le mutant DHOPEMN, de très faibles quantités de protéines YopB et YopD sont détectées dans la fraction membranaire de GRM infectés par la souche sauvage. Ceci pourrait être expliqué par le fait que la souche sauvage nécessite une activation de la sécrétion du SSTT alors que toutes les autres souches mutantes utilisées sont déficientes pour YopN et sécrètent donc constitutivement les protéines du SSTT (Forsberg et al., 1991). De plus, il est probable que l’utilisation des hématies comme modèle cellulaire ne permet pas une activation importante de la sécrétion de type III. Ainsi, de faibles quantités de protéines translocatrices sont sécrétées et insérées dans les membranes des hématies. Afin de valider cette hypothèse, il est nécessaire de réaliser des expériences similaires avec une souche de Y. enterocolitica déficiente uniquement pour la protéine YopN.