ASSEMBLAGE DU PORE DE TRANSLOCATION
2- Insertion des protéines translocatrices PopB et PopD dans les membranes d’hématies
J’ai donc choisi d’utiliser le modèle d’infection érythrocytes/P. aeruginosa pour étudier la présence des protéines PcrV, PopB et PopD dans les membranes de cellules eucaryotes infectées. Ce système minimal permet d’obtenir une importante activité cytotoxique type III-dépendante, à une MOI faible (MOI de 1) et dans un temps assez court (une heure d’infection). De plus, les globules rouges de moutons (GRM) sont des cellules disponibles en grand nombre à un prix très raisonnable et les membranes de GRM infectés par
P. aeruginosa peuvent être assez facilement isolées sans contamination bactérienne.
J’ai tout d’abord recherché la présence des protéines PcrV, PopB et PopD dans les membranes isolées de GRM infectés par la souche sauvage CHA ou par le mutant CHADpopBD.
On observe, sur la figure IV.1A, que les protéines translocatrices PopB et PopD sont retrouvées en quantité significative dans les membranes d’hématies infectées par la souche parentale CHA, alors que PcrV n’est jamais retrouvée associée aux membranes de GRM.
Figure IV.1. Insertion des protéines PopB et PopD dans les membranes d’hématies infectées par CHA.
(A) Les GRM ont été infectés par les différentes souches de P. aeruginosa indiquées sur la figure, à une MOI de 1, pendant 1 h à 37°C. L’hémolyse a été mesurée pour chaque infection. Le signe (+) signifie que l’hémolyse mesurée est supérieure à 70% et le signe (-) signifie qu’elle est inférieure à 20%. Les membranes infectées ont été isolées par flottaison sur un gradient de saccharose discontinu, puis concentrées par ultracentrifugation.
(B) Détermination du type d’association de PopB et PopD aux membranes d’hématies. Les membranes de GRM infectés par CHADpopBD/popBD sont isolées, puis incubées pendant 1 h à 4°C, en Tris salin, ou en Tris salin contenant 5 M de NaCl ou 0,2 M de carbonate pH 11,0. Les protéines présentes dans le culot membranaire ont été séparées par SDS-PAGE puis analysées en Western blot à l’aide des anticorps polyclonaux purifiés anti-PcrV (1/3000ème),
anti-PopB (1/5000 ème), et du sérum polyclonal anti-PopD (1/1000 ème).
Des échantillons de membranes de GRM infectés par les différentes souches bactériennes ont été observés en microscopie électronique à transmission, après avoir été colorés négativement (paragraphe 4 de ce chapitre). Aucune bactérie n’a été observée en MET dans ces échantillons. Les protéines retrouvées dans les fractions membranaires de GRM infectés ne proviennent donc pas de bactéries contaminantes présentes dans les échantillons de membranes.
Le type d’association des protéines PopB et PopD avec les membranes d’hématies a été étudié à partir de membranes isolées de GRM infectés par CHADB D/popBD. Ces membranes ont été traitées avec des concentrations élevées en sels (NaCl 5M) ou à pH alcalin (Na2CO3 0,2 M, pH 11,0), traitements connus pour détacher les protéines membranaires
périphériques associées aux membranes, via respectivement des interactions électrostatiques ou hydrophiles. On observe sur la figure IV.1B, qu’après ces traitements, la majorité des protéines PopB et PopD reste associée aux membranes des GRM.
Cette forte association de PopB et PopD aux membranes des GRM, ainsi que la prédiction de domaines transmembranaires en hélice a dans ces protéines translocatrices suggèrent fortement que ces protéines sont insérées dans les membranes des GRM.
Sur la figure IV.2, on observe que les anticorps anti-PcrV et anti-PopB, utilisés aux mêmes dilutions que dans les Western blots présentés dans les figures IV.1, IV.3 et IV.4, ont un seuil de détection comparable. L’absence systématique de PcrV dans la fraction membranaire d’hématies infectées par la souche parentale CHA n’est donc pas due à une faible affinité des anticorps anti-PcrV utilisés. Par ailleurs, on peut noter sur cette même figure que le sérum polyclonal anti-PopD possède un seuil de détection environ 50 fois moins élevé que les anticorps polyclonaux purifiés anti-PopB. La purification du sérum polyclonal anti-PopD par chromatographie d’affinité ne m’a pas permis d’obtenir une fraction purifiée possédant un seuil de détection plus élevé. Ainsi, afin de compenser partiellement cette faible affinité du sérum polyclonal anti-PopD pour son antigène, j’ai systématiquement déposé deux fois plus de membranes isolées de GRM infectés sur les gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) destinés à la recherche de PopD par Western blot.
Figure IV.2. Comparaison de l’affinité des anticorps anti-PopB, anti-PopD et anti-PcrV.
Le seuil de détection de ces trois anticorps est comparé en Western blot à l’aide des protéines recombinantes PopB, PopD et PcrV purifiées. Les anticorps sont utilisés aux mêmes dilutions que dans la figure précédente.
Par ailleurs, j’ai réalisé des expériences similaires de fractionnement d’hématies infectées par les souches isogéniques de CHA déficientes pour PopB ou PopD (figure IV.3). On observe sur cette figure, que PopB est insérée dans les membranes de GRM en l’absence de PopD (DBD/popB) et inversement, que l’absence de PopB (DBD/popD) n’affecte pas l’insertion de PopD dans les membranes d’hématies. Les quantités de protéines PopB et PopD, qui sont insérées dans les membranes de GRM infectés par les souches complémentées CHADBD/popB, CHADBD/popD et CHADBD/popBD, sont beaucoup plus importantes que les quantités de PopB et PopD retrouvées dans les membranes de GRM infectés par la souche parentale CHA (figure IV.3). Cette différence peut s’expliquer par le fait que les complémentations du mutant CHADpopBD sont réalisées avec un plasmide dit «"à nombre moyen de copies"». Cela signifie que chaque souche est complémentée par une dizaine de plasmides, ainsi ces souches possèdent une dizaine de copies des gènes popB et/ou popD alors que la souche parentale n’en possède qu’une.
On peut également remarquer que l’unique insertion de PopB ou PopD dans les membranes d’hématies, n’induit pas la formation de pores provoquant la lyse (figure IV.3).
Figure IV.3. Isolement des membranes de GRM infectées par les mutants DB et DD.
Les GRM ont été infectés par les quatre souches indiquées sur la figure, à une MOI de 1, pendant 1 h à 37°C. L’hémolyse a été mesurée pour chaque infection. Le signe (+) signifie que l’hémolyse mesurée est supérieure à 70% et le signe (-) signifie qu’elle est inférieure à 20%. Les membranes infectées ont été isolées, puis concentrées par ultracentrifugation. Les protéines présentes dans le culot membranaire ont été séparées par SDS-PAGE, puis analysées en Western blot.
Le détergent non-ionique Triton X-100 (TX-100) est utilisé pour solubiliser les protéines membranaires intégrales. L’insolubilité au TX-100 1% à basse température est l’une des caractéristiques biochimiques des protéines associées aux micro-domaines membranaires riches en sphingomyéline et cholestérol, également appelé radeaux lipidiques. Des résultats préliminaires montrent qu’une proportion significative de protéines PopB insérées dans les membranes de GRM n’est pas solubilisée par le traitement au TX-100 (figure IV.4). Ce résultat suggère qu’une quantité significative de PopB s’accumule au niveau des radeaux lipidiques de la membrane cytoplasmique de la cellule eucaryote. Toutefois, la validation de ces résultats nécessite la réalisation de contrôles avec des protéines membranaires intégrales, localisées au niveau des radeaux lipidiques comme la cavéoline-1 et la calnexine.
Figure IV.4. Accumulation de PopB dans la fraction insoluble au TX-100.
Les membranes de GRM infectés par CHADBD/popBD sont isolées, concentrées puis incubées pendant 30 min à 4°C avec remise en suspension, en Tris salin 1% Triton X-100 (TX-100). La fraction insoluble (C) est séparée par ultracentrifugation du matériel soluble (S), puis la protéine PopB est recherchée dans ces deux fractions par Western blot.
Ces résultats permettent de conclure que la partie membranaire du translocon, insérée dans la membrane cytoplasmique des cellules eucaryotes cibles, est composée des protéines PopB et PopD.