ASSEMBLAGE DU PORE DE TRANSLOCATION
B. Photographie en négatif de l’image d’un pore numérisé avec le logiciel Samba Technologies IPS.
2- Les anticorps anti-PcrV protègent les GRM de l’hémolyse SSTT-dépendante de P aeruginosa
Il a été montré que les anticorps (Ac) polyclonaux purifiés anti-PcrV protègent les macrophages de la lyse induite par P. aeruginosa (Sawa et al., 1999). Pour valider l’utilisation des hématies comme modèle cellulaire pour les expériences d’immunoprotection, j’ai effectué un test préliminaire avec les Ac anti-PcrV produits dans le laboratoire (figure V.1). Les anticorps anti-PcrV, à une concentration finale de 25 ng/ml, inhibent la quasi-totalité
de l’activité hémolytique type III-dépendante de P. aeruginosa alors que le sérum pré-immun n’a aucun effet sur cette activité hémolytique (figure V.1). Le niveau de protection des GRM est similaire que les anticorps protecteurs soient pré-incubés avec les bactéries ou avec les GRM (figure V.1).
Figure V.1. Anticorps anti-PcrV protègent les GRM de l’hémolyse type III-dépendante de P. aeruginosa.
Les bactéries ou les hématies sont pré-incubées pendant 45 minutes avec des anticorps polyclonaux purifiés anti-PcrV. Le test d’hémolyse est ensuite réalisé à une MOI de 1 et à une concentration finale de 25 ng d’anticorps/ml. Après 1 heure d’incubation à 37°C, l’hémolyse est évaluée en mesurant le relargage d’hémoglobine dans le surnageant d’infection. L e contrôle négatif est réalisé en pré-incubant les bactéries avec du sérum pré-immun de lapin.
Afin de tester la capacité des anticorps spécifiques des protéines, PcrV, PopB et PopD, essentielles à l’activité formatrice de pores de P. aeruginosa, j’ai réalisé des expériences d’immunoprotection en utilisant des concentrations croissantes d’anticorps de 0,05 ng à 50 ng d’Ac/ml (figure V.2). Ces concentrations correspondent à une variation d’environ 8.102 à 8.105
du rapport « nombre d’anticorps par bactérie"». Ces expériences sont réalisées dans des microplaques 96 puits, à une MOI de 1. Les bactéries sont préalablement incubées avec les anticorps à tester pendant 45 minutes à température ambiante. L’infection est initiée par une centrifugation de 10 minutes à 1 500 g afin de favoriser le contact entre les bactéries et les
hématies. Après une heure d’incubation à 37°C, l’hémolyse est évaluée en mesurant par spectrophotométrie le relargage d’hémoglobine dans le surnageant d’infection. Les anticorps anti-PcrV, anti-PopB et anti-PopD ont été préalablement purifiés par chromatographie d’affinité à partir de sérums polyclonaux de lapin (cf. «"Matériels et Méthodes"», § 4C). Les anticorps polyclonaux de souris dirigés spécifiquement contre LcrV de Y. pestis, ont été produits et purifiés par le Dr. O. Attrée (CRSSA, La Tronche, France). L’anticorps monoclonal Mab166, généré et caractérisé par le Dr. D. Frank, reconnaît spécifiquement un large épitope de PcrV (résidus 158 à 217) (Frank et al., 2002).
On observe sur la figure V.2 que des concentrations très faibles d’Ac polyclonaux purifiés anti-PcrV réduisent significativement l’activité hémolytique SSTT-dépendante de P.
aeruginosa. En effet, ces anticorps à une concentration finale de 0,25 ng/ml induisent une diminution de 50% de l’activité hémolytique de P. aeruginosa. Au-delà de 10 ng/ml, soit un rapport anticorps par bactérie d’environ 1,6.105, ces anticorps confèrent aux GRM une
protection quasi totale. Enfin, on peut voir qu’entre 0,05 et 10 ng/ml, l’inhibition de l’hémolyse induite par les anticorps polyclonaux purifiés anti-PcrV est dose dépendante (Figure V.2).
Il a été montré que l’anticorps monoclonal Mab166 protège les souris d’infections létales à P. aeruginosa (Frank et al., 2002). On observe que cet anticorps inhibe, de façon dose dépendante, l’activité hémolytique de P. aeruginosa (figure V.2). À des concentrations supérieures à 25 ng/ml, l’anticorps Mab166 protège la quasi-totalité des GRM de l’hémolyse induite par le SSTT. Toutefois, cet anticorps est moins efficace que les anticorps polyclonaux anti-PcrV puisque l’inhibition de 50% de l’hémolyse nécessite environ 17 fois plus d’anticorps Mab166 (4,3 ng/ml) que d’anticorps polyclonaux (0,25 ng/ml) (figure V.2).
Les protéines LcrV de Yersinia spp. et PcrV de P. aeruginosa, qui présentent environ 41% d’identité au niveau des acides aminés (Yahr et al., 1997), sont essentielles à la formation du pore de translocation (Bröms et al., 2003c; Goure et al., 2004; Pettersson et al., 1999; Sarker et al., 1998a; Sawa et al., 1999; Sundin et al., 2001). Ces deux protéines partagent probablement la même fonction dans l’assemblage de ce pore (Goure et al., 2004). De la même façon que les Ac polyclonaux anti-PcrV et les Ac Mab166, les Ac polyclonaux spécifiques de LcrV de Y. pestis protègent les GRM de l’hémolyse induite par le SSTT de P.
PcrV puisqu’ils induisent une diminution de 50% de l’activité hémolytique à une concentration finale de 10 ng/ml, soit une concentration quarante fois supérieure à celle des Ac polyclonaux anti-PcrV (0,25 ng/ml) (figure V.2). La capacité des Ac polyclonaux anti- LcrV à protéger les GRM d’infections à P. aeruginosa suggèrent qu’il existe des épitopes protecteurs communs entre PcrV et LcrV.
Figure V.2. Effet dose dépendant de la protection conférée par les anticorps protecteurs.
La souche CHA de P. aeruginosa est pré-incubée pendant 45 minutes avec des quantités variables d’anticorps polyclonaux de lapin purifiés anti-PcrV (Ac a-PcrV), anti-PopB (Ac a- PopB) ou anti-PopD (Ac a-PopD) et d’anticorps polyclonaux de souris purifiés anti-LcrV (Ac a-LcrV) ou d’anticorps monoclonaux de souris Mab166. Le test hémolytique est ensuite réalisé avec ce mélange de bactéries et d’anticorps, à une MOI de 1.
Enfin, on peut voir que les Ac polyclonaux purifiés, dirigés spécifiquement contre les protéines translocatrices PopB ou PopD, n’affectent pas l’activité hémolytique de P.
par les anticorps capables de reconnaître PcrV est liée à la spécificité de ces anticorps et non à la quantité d’anticorps utilisé.
J’ai également testé le pouvoir protecteur d’anticorps polyclonaux purifiés spécifiques de PscF qui est le composant majeur de l’aiguille de l’injectisome chez P. aeruginosa. Cette aiguille est très probablement accessible aux anticorps puisqu’elle est localisée à la surface des bactéries. Cependant, les Ac anti-PscF, utilisés à des concentrations de 25, 50 et 100 ng/ml, ne protègent pas les GRM de l’hémolyse, qu’ils soient pré-incubés avec les bactéries ou avec les hématies (données non montrées).
Les protéines PcrV et LcrV sont des antigènes exposés à la surface de la bactérie (Pettersson et al., 1999; Ina Attrée, communication personnelle) et sont donc probablement accessibles aux anticorps. Afin de confirmer que la protection contre l’hémolyse conférée par les Ac anti-PcrV est due à une interaction directe entre ces anticorps et l’antigène au cours de l’infection, j’ai réalisé des expériences de compétition de la protection avec les protéines recombinantes PcrV (PcrVr) et LcrV (LcrVr). Pour ces expériences, 5.107 bactéries ont été
incubées avec les Ac polyclonaux purifiés anti-PcrV à une concentration finale de 5 ng/ml et des quantités croissantes de protéines PcrVr ou LcrVr afin de faire varier le rapport molaire protéine/anticorps entre 0,05 et 50 (figure V.3).
On observe sur la figure V.3 que l’ajout d’antigènes recombinants PcrV, à un rapport molaire d’environ 3-4 molécules de PcrV pour 10 molécules d’anticorps anti-PcrV, induit une inhibition de 50% de la protection conférée par 5 ng/ml de cet anticorps (8.104 molécules
d’anticorps). Au-delà d’un rapport molaire PcrVr/Ac a-PcrV de 1, la quasi-totalité de la capacité protectrice des Ac polyclonaux anti-PcrV est neutralisée (figure V.3). Par contre, l’antigène recombinant LcrV est incapable de titrer la protection conférée aux GRM par les Ac anti-PcrV, même à un rapport molaire LcrVr/Ac a-PcrV de 50. Ces résultats confirment que l’inhibition de l’activité hémolytique, par les anticorps anti-PcrV est propre à la spécificité de ces anticorps, lesquels très probablement neutralisent la fonction biologique de PcrV dans l’assemblage du pore de translocation.
Figure V.3. Titration des anticorps protecteurs anti-PcrV par les protéines recombinantes PcrV et LcrV.
La souche CHA de P. aeruginosa est pré-incubée avec des anticorps polyclonaux purifiés anti-PcrV à une concentration finale de 5 ng/ml et des quantités croissantes de protéines recombinantes PcrV (PcrVr) ou LcrV (LcrVr) afin de faire varier le rapport molaire protéine/anticorps entre 0,05 et 50. Le test hémolytique est ensuite réalisé à une MOI de 1. Le pourcentage de protection est calculé en utilisant comme 100% de protection, le pourcentage d’hémolyse mesuré avec 5 ng d’Ac a-PcrV /ml.