5.B.1- Préparation de P. aeruginosa pour les infections cellulaires
Les bactéries, en phase stationnaire, sont diluées à une DO600 de 0,2 et remises en
culture à 37°C, 300 rpm jusqu’à ce que la DO600 soit comprise entre 1 et 1,2 (phase
exponentielle de croissance). Les bactéries sont collectées par une centrifugation de 10 min à 10 000 rpm, à température ambiante. Les bactéries sont lavées dans le milieu de culture utilisé pour l’infection. Elles sont ensuite resuspendues dans le milieu d’infection à la concentration souhaitée, à partir de cette relation: une unité de DO600 correspond à 6.10
8 P. aeruginosa /ml.
La concentration, à laquelle sont diluées les bactéries, est établie selon la multiplicité d’infection (MOI).
5.B.2- Test de cytotoxicité envers les macrophages
L’infection est réalisée en plaques 24 puits dans un volume final de 300 ml. Environ 24 h avant l’infection, 3 à 5.105 macrophages sont déposés dans chacun des puits dans un volume
final de 1 ml de DMEM complémenté avec 10% de SVF décomplémenté, puis incubés toute la nuit à 37°C, 5% CO2. Une heure avant l’infection, les cellules sont rincées avec 300 ml de
DMEM, puis ré-incubées à 37°C, 5% CO2 dans 200 ml de DMEM. Les macrophages sont
infectés avec 100 ml d’une suspension bactérienne (préparée comme décrit dans le paragraphe précedent) à une MOI de 10, puis incubés 2 h à 37°C, 5% CO2. La cytotoxicité est estimée en
mesurant l’activité lactate déshydrogénase (LDH) qui est une enzyme cytoplasmique soluble, relarguée dans 30 ml de surnageant cellulaire (60 ml pour le témoin positif), avec le kit de dosage de la LDH (Cytotoxicity Detection Kit, Roche Diagnostique). Le témoin négatif est réalisé en incubant les macrophages dans 300 ml de DMEM. Il correspond au niveau basal de relargage de LDH par les macrophages. Le témoin positif correspond à la lyse totale des macrophages. Il est réalisé en incubant les cellules avec 300 ml de DMEM, 0,1% (v/v) Triton X-100.
5.B.3- Test d’hémolyse
Le test d’hémolyse est adapté de Blocker et al. (1999). Les GRM sont lavés trois fois en PBS, pH 7,4 (150 mM NaCl) puis resuspendus à une concentration de 5.108 GRM/ml dans du milieu RPMI-1640 modifié (Roswell Park Memorial Institute- 1640, sans L-glutamine et rouge de phénol) et conservés à 4°C. Les bactéries sont préparées comme décrit dans le paragraphe 5.B.1, puis resuspendues à 5.108 bactéries/ml dans du milieu RPMI-1640 modifié.
L’hémolyse est réalisée dans des plaques 96 puits à fond rond. 100 ml de la suspension de GRM et 100 ml de la suspension bactérienne sont déposés dans chacun des puits. L’infection est initiée par une centrifugation (10 min, 1 500 g à température ambiante) et poursuivie 1 h à 37°C. Après centrifugation (10 min, 1 500 rpm à 4°C), 100 ml de surnageant cellulaire est prélevé. L’hémolyse est alors évaluée par la mesure du relargage d’hémoglobine dans le surnageant à 540 nm. Le pourcentage (%) d’hémolyse est calculé avec la formule suivante": % d’hémolyse = ((X-B)/(T-B)) x 100. B est le contrôle négatif correspondant à la lyse naturelle des GRM. Il est réalisé par incubation des GRM avec 100 ml de RPMI-1640 modifié. T est le contrôle positif correspondant à la lyse totale des GRM. Il est obtenu en
incubant les GRM avec 100 ml de RPMI-1640 modifié, 0,1% (m/v) de SDS. X est la valeur de la DO540 de l’échantillon analysé.
Pour les expériences d’osmoprotection, on a réalisé des solutions stériles de chaque molécule osmoprotectrice à une concentration de 60 mM dans du milieu RPMI-1640 modifié. Les GRM lavés sont resuspendus à une concentration de 5.108 GRM/ml dans ces différentes
solutions, puis l’hémolyse est réalisée comme décrit ci-dessus.
5.B.4- Expérience d’immunoprotection des GRM
Les expériences d’immunoprotection des GRM sont réalisées aussi bien en microplaques qu’en tubes Falcon de 50 ml à fond conique.
Cette expérience est utilisée pour évaluer la capacité des anticorps à protéger les globules rouges de la lyse médiée par P. aeruginosa. Le protocole expérimental est identique à celui des tests d’hémolyse (cf. § 4.D et 5.B.3), à l’exception de la préparation des bactéries. Ces dernières sont diluées dans le milieu utilisé pour l’infection, en présence de l’anticorps à tester puis incubées pendant 45 min à température ambiante. Après cette incubation, les bactéries, en présence des anticorps, sont mélangées aux GRM, puis l’infection est initiée par centrifugation. La concentration d’anticorps varie selon la quantité de bactéries utilisées pour l’infection. Des concentrations différentes d’anticorps ont été testées. Le pourcentage d’hémolyse est calculé ainsi que le pourcentage d’inhibition de l’hémolyse en prenant comme 100% d’inhibition, le pourcentage d’hémolyse obtenu avec la concentration la plus élevée d’anticorps.
6- Techniques de microscopie électronique
Les expériences de microscopie électronique ont été réalisées en collaboration avec Guy Brochier (Service d’Imagerie et de Microscopie Electronique, CRSSA, La Tronche).
Après avoir été isolées par flottaison sur un gradient saccharose, les membranes de GRM sont concentrées par ultra-centrifugation à 450 000 g, pendant 20 min à 4°C dans des tubes TLA 100.3 (Beckman Corp.). Afin de fixer les échantillons, le culot membranaire est repris dans du paraformaldéhyde 1,5% en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) pendant 1h sur la glace. Les membranes sont ensuite à nouveau ultra-centrifugées, avant d’être reprises dans 100 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4).
Ensuite, 5 ml de cette solution de membranes fixées est déposés pendant 3 minutes sur une grille de cuivre recouverte de Formvar et de carbone (Formvar-coated copper grid, 400 mesh, Agar Scientific). L’excès de solution est éliminé, puis la coloration négative est réalisée par un bain de 10 secondes à l’obscurité dans de l’acétate d’uranyle 1%. La grille est ensuite placée, échantillon vers le haut, sur un papier-filtre dans une boîte de Pétri pour séchage, pendant environ 1 h.
L’échantillon est observé et photographié avec un Microscope Electronique à Transmission JEOL 1010 sous un voltage de 80 kV.
Les photographies prises en coloration négative peuvent être ensuite numérisées avec le logiciel Samba Technologies IPS.