B- Les voies de synthèse du NAD chez les plantes
3) La conversion du NaMN en NAD chez les plantes
La conversion du NaMN en NAD se fait en deux étapes, (i) premièrement l’adénylation du NaMN en nicotinate adénine dinucléotide (NaAD), suivie (ii) de l’amidification du NaAD en NAD (Ashihara et al., 2005; Noctor et al., 2006). La première étape est catalysée par la nicotinate mononucléotide/nicotinamide mononucléotide adényltransférase (NaMN/NMNAT) et la seconde par la NAD synthétase (NADS ; Figure 3). Ces étapes enzymatiques sont communes à la voie de biosynthèse de novo et l’une des voies de recyclage du NAD.
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a- La nicotinate mononucléotide/nicotinamide mononucléotide adényltransférase (NaMN/NMNAT)
La NaMNAT (EC 2.7.7.18) catalyse l’adénylation du NaMN en NaAD et est le produit du gène nadD chez les bactéries (Figure 3). Cette réaction nécessite l’énergie de l’ATP et consiste en une attaque nucléophile du groupement phosphoryle en 5’ du NaMN sur le phosphate en de l’ATP, facilitée par la liaison d’ions Mg2+ (Figure 7). Chez Escherichia coli, la levure et l’Homme, cette enzyme est capable d’utiliser le NaMN et le nicotinamide mononucléotide (NMN) comme substrats avec une préférence 1000 fois supérieure pour le NaMN, en se basant sur les valeurs de Kcat/Km pour chacun des substrats (Dahmen et al., 1967; Magni et al., 2004; Lau et al., 2010). Chez l’Homme, cette étape enzymatique est l’une des cibles pharmacologiques privilégiées d’agents thérapeutiques anti-infectieux ou utilisés dans le traitement des cellules cancéreuses (Pan et al., 2014).
Figure 7. Réaction catalysée par la NaMNAT aboutissant à la formation du NaAD.
Chez les plantes, une activité NMNAT a aussi été détectée dans les racines du tabac et les tubercules de topinambour. L’enzyme purifiée chez le tabac, présente une activité spécifique nettement inférieure en présence de NMN en comparaison de celle mesurée avec le NaMN comme substrat (0.67 nmol.min-1.mg-1 pour le NMN contre 3.58 nmol.min-1.mg-1 pour le NaMN ; Wagner et al., 1986a). Plus récemment, une activité NMNAT a été détectée dans des mitochondries de tubercules de topinambour (Di Martino & Pallotta, 2011). Dans ce cas l’activité de la fraction protéique purifiée de mitochondries utilise préférentiellement le NMN (3.8 nmol.min
-1.mg-1 pour le NMN contre 0.9 nmol.min-1.mg-1 pour le NaMN ; Di Martino & Pallotta, 2011). Cette activité NMNAT, spécifique de la fraction mitochondriale, joue
28 certainement un rôle important dans le métabolisme du NAD mitochondrial chez les plantes, probablement dans le recyclage du NMN produit par le catabolisme du NAD dans ce compartiment (Figure 3). Chez l’Homme, trois isoformes de NaMNAT sont adressées aux compartiments nucléaire, cytosolique et mitochondrial (Berger et al., 2005) et l’isoforme nucléaire NaMNAT-1 est en fait une NMNAT qui permet le recyclage du NMN produit dans le noyau par le catabolisme du NAD (Zhang et al., 2012).
Chez Arabidopsis thaliana, un gène unique (At5g55810) code la NaMNAT, et l’analyse des séquences disponibles dans les bases de données n’a pas permis de mettre en évidence un gène spécifique de la NMNAT. Comme chez les bactéries et les autres Eucaryotes, ce gène code probablement pour une enzyme bifonctionnelle NaMN/NMNAT adressée à différents compartiments subcellulaires, Hashida et al. (2006) l’ayant localisée vaguement dans le « cytoplasme » en 2006 (Takahashi et al., 2006). Chez Arabidopsis thaliana, l’interruption du gène codant la NaMNAT est comme pour les trois premières enzymes de la voie de synthèse de novo du NAD, létale à l’état homozygote. Cette enzyme semble par conséquent indispensable à la biosynthèse du NAD (Katoh et al., 2006). Comme décrit plus loin dans la section intitulée « le rôle du NADPH dans les processus développementaux », des mutants d’Arabidopsis thaliana dérégulés dans leur production de NaMNAT sont affectés dans certains processus physiologiques et développementaux, en particulier en situation de stress (Hashida et al., 2007; Hashida et al., 2010; Hashida et al., 2013b; Hashida et al., 2013c).
b- La NAD synthétase
La NAD synthétase (NADS, EC 6.3.5.1) convertit le NaAD en NAD en transformant la fonction acide de la partie nicotinate du NaAD en fonction amide. Le Mg2+ est essentiel dans cette activité puisqu’il va activer le groupement phosphate de l’ATP, stabiliser le groupement partant pyrophosphate (PPi) et faciliter l’attaque de l’ammoniac (NH3 ; Figure 8 ; Ozment et al., 1999). Chez Mycobacterium tuberculosis et Helicobacter pylori, il a longtemps été pensé que ces organismes étaient dépourvus de voie de recyclage du NAD. C’est pourquoi la NADS mais aussi la NaMNAT constituent des cibles privilégiées pour la recherche de nouveaux agents
29 antibactériens (Warren et al., 1983; Boshoff et al., 2008), surtout depuis l’apparition récente de formes résistantes à certains traitements (Rodionova et al., 2014).
Figure 8. Réaction catalysée par la NAD synthétase (NADS). ADP, adénosine diphosphate ; AMP, adénosine monophosphate ; ATP, adénosine triphosphate ; PPi, pyrophosphate.
La NADS, produit du gène nadE chez les bactéries (Figure 3), est codée par le gène At1g55090 chez Arabidopsis thaliana et l’absence de peptide d’adressage dans la séquence protéique de l’enzyme indiquerait une localisation cytosolique de celle-ci (Hunt et al., 2004; Katoh et al., 2006; Noctor et al., 2006).
Selon l’espèce considérée, la NADS utilise le NH3 et/ou un acide aminé donneur d’amine comme substrat. Ainsi, chez Escherichia coli, la NADS accepte uniquement le NH3 comme substrat (Km pour le NH4Cl de 65 µM ; Spencer & Preiss, 1967), alors que chez la levure et le rat l’enzyme accepte le NH4Cl (Km = 140 µM) et la glutamine (Km = 35 µM), même si la glutamine (Gln) serait le substrat physiologique (Preiss & Handler 1958b). L’enzyme de plante accepte préférentiellement la Gln et peut utiliser l’asparagine (Asn), mais pas le NH3 (Wagner et al., 1986a). L’apparition de la capacité de la protéine à utiliser le Gln comme donneur d’amine résulterait de l’acquisition d’un domaine protéique supplémentaire de type nitrilase en extrémité C-terminale de la protéine (De Ingeniis et al., 2012) que l’on retrouve uniquement chez les Eucaryotes et les cyanobactéries (Gerdes et al., 2006).
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