L’inflammation induite par différents bactériophages

1. Induction de l’inflammation par les bactériophages sur une lignée cellulaire pulmonaire

La lignée cellulaire MHS, macrophages alvéolaires murins, a été utilisée pour tester l’induction de 3 cytokines pro-inflammatoires (IL-6, KC et TNF-), après une stimulation de 24 h par les bactériophages P3-CHA, PAK-P3, LUZ19 et KZ. Les bactériophages P3-CHA et PAK-P3 sont des Myoviridae qui diffèrent seulement par 2 mutations dans leur génome mais sont amplifiés sur des souches différentes. Ils ont été choisis afin de mettre en évidence une éventuelle influence de la souche utilisée pour l’amplification sur l’induction de

l’inflammation. Les bactériophages LUZ19 et KZ ont en revanche la même souche

d’amplification, PAO1, mais le premier est un membre de la famille des Podoviridae tandis que le second appartient à la famille des Myoviridae. Le ratio [nombre de bactériophages / nombre de cellules stimulées] utilisé est de 100. La dégradation des bactériophages dans le surnageant de culture cellulaire, au cours des 24 h de stimulation, a été déterminée par titration et est inférieur à ½ log pour chacun des bactériophages. Dans ces conditions, les bactériophages n’induisent pas de production de cytokines pro-inflammatoires et semblent donc être faiblement immunogènes, indépendamment de la famille à laquelle ils appartiennent et de la souche sur laquelle ils ont été amplifiés (Figure 30).

Figure 30 : Dosage de 3 cytokines pro-inflammatoires dans les surnageants de culture de cellules MHS stimulées par 4 bactériophages

Des macrophages alvéolaires murins (lignée MHS) ont été stimulés, pendant 24 h, avec 107 pfu du bactériophage P3-CHA, PAK-P3, LUZ19 ou KZ, avec un lysat bactérien contenant 107pfu de P3-CHA ou avec une solution contrôle (tampon Tris-NaCl). La concentration de chacun des facteurs dans les surnageants de culture a été déterminée par dosage ELISA. Les lignes pointillées représentent, pour chacun des facteurs, le seuil de détection. Les données non représentées correspondent à des valeurs inférieures à ce seuil. Les valeurs sont les moyennes (± Erreur Standard) obtenues à partir de 3 réplicats pour l’IL-6 et un réplicat pour les autres facteurs.

2. Réponse inflammatoire dans des lavages broncho-alvéolaires de souris

L’étude a été réalisée avec le bactériophage P3-CHA, le mieux caractérisé des bactériophages spécifique de la souche CHA. Nous avons utilisé le modèle d’infection pulmonaire aiguë décrit au paragraphe III avec les adaptations suivantes : les souris cftr -/- et leur contrôle de type sauvage (WT) ont reçu une ½ dose curative de bactériophages par voie intranasale ou un traitement PBS contrôle, avec ou sans infection 2 h auparavant (½ dose létale de P. aeruginosa, souche CHA). Les mesures sont réalisées dans les lavages broncho- alvéolaires (BAL) des souris, 16 h après l’infection ou le traitement par bactériophages seuls.

a)

Quatre facteurs inflammatoires ont été étudiés, l’IL-6, la KC, le TNF- et la prostaglandine PGE-2 (Figure 31). Les données obtenues sur les souris WT et cftr -/- ne sont

Résultats doses curatives de bactériophages, diffèrent d’un facteur 3 entre les deux type de souris. Cependant, les profils sont similaires. Dans les BAL des souris CF ayant uniquement reçu une dose curative du bactériophage P3-CHA, la concentration des 4 facteurs est au maximum 1.5 fois celle mesurée dans les BAL des souris CF ayant reçu un traitement contrôle. Pour les souris WT, cette concentration est multipliée jusqu’à ~ 8 fois pour l’IL-6 et ~ 3 fois pour la PGE-2, cependant en condition infectieuse, la concentration d’IL-6 et de PGE-2, dans les BAL de ces souris WT, est multipliée par 267 et 20 respectivement. Le bactériophage P3- CHA semble donc être très faiblement immunogène in vivo chez la souris, sans commune mesure avec l’inflammation induite par un agent pathogène.

La concentration de TNF-est relativement faible, pour l’ensemble des conditions, probablement en raison du moment du sacrifice, 16 h post-infection, alors que le TNF-est une cytokine pro-inflammatoire produite très précocement (1-4 h).

La production de KC, équivalent murin de l’IL-8 humaine, induite par l’infection est réduite lors d’un traitement par bactériophages administré 2 h après l’infection, chez les souris WT. Cette réduction est aussi observée pour le TNF- En revanche, les concentrations d’IL-6 et de PGE-2 ne sont pas réduite par le traitement par bactériophages. C’est l’inverse chez la souris cftr-/-, 3 des 4 facteurs de l’inflammation étudiés présentent des concentrations plus importantes dans les BAL des souris infectées puis traitées, que dans les BAL des souris uniquement infectées. Cependant, le ratio entre les deux concentrations est seulement de 2 à 5 en fonction du facteur inflammatoire considéré. Globalement, le traitement par bactériophages n’induit donc pas une sur-inflammation importante, ni dans ce modèle murin de mucoviscidose, ni chez leur contrôles WT où il permet même une réduction de l’inflammation.

Figure 31 : Dosage de cytokines pro-inflammatoires et de la prostaglandine PGE-2 dans des lavages broncho-alvéolaires de souris en conditions d’infection et/ou de traitement Des souris de type sauvage (A) et invalidées pour le gène cftr (B) ont été soumises à 4 conditions : traitement PBS, traitement intranasal avec 1.5x107(A) et 0.5x107(B) pfu du bactériophage P3-CHA, infection intranasale avec 1.5x106(A) et 0.5x106(B) cfu de la souche CHA ou infection puis traitement 2 h après avec les mêmes doses respectivement. Les souris ont étés sacrifiées 16 h après l’infection ou le traitement par bactériophages seul puis des lavages broncho-alvéolaires (BAL) ont été réalisés sur chaque animal. La prostaglandine PGE-2 ainsi que 3 cytokines pro-inflammatoires ont été dosées dans ces BAL par ELISA. Les valeurs sont les moyennes des ratios ± Erreur Standard. ns : non significatif ; * : p < 0.05 ; ** : p < 0.01 et *** : p < 0.001 de couleur noire en comparaison au traitement PBS et de

Résultats

b)

Le dénombrement des neutrophiles a été réalisé sur cellules de Malassez observée au microscope photonique. 16 h post-traitement, la concentration de neutrophiles dans les BAL des souris, WT comme cftr -/-, est inférieure à 105 / mL (seuil de dénombrement) lorsqu’elles reçoivent uniquement un traitement par bactériophages, tout comme lorsqu’elles reçoivent un traitement contrôle. Lors de l’infection pulmonaire par la souche CHA, 1.5x106 et 2x106 neutrophiles par mL de BAL sont respectivement dénombrés chez les souris WT et cftr -/-. Cette concentration n’est pas significativement réduite lorsque les souris infectées reçoivent une dose curative de bactériophages (1.9x106 et 1.1x106 neutrophiles / mL de BAL chez les souris WT et cftr -/- respectivement ; Test de Mann-Whitney). Ces résultats montrent que l’administration intranasale de bactériophages ne stimule ni la prolifération, ni le recrutement des PMN de manière suffisamment importante pour que cela soit observable dans les BAL 16 h après le traitement. Cela est en accord avec les faibles concentrations des médiateurs inflammatoires mesurées dans les BAL de ces souris.