C. L’influence des bactériophages sur le transport ionique
2. Exploration du transport ionique dans le contexte d’une d’infection pulmonaire à P aeruginosa et / ou
bactériophages
Comme pour la partie de l’étude portant sur l’inflammation, le bactériophage P3-CHA a été utilisé. Le modèle d’infection pulmonaire aiguë utilisé est également le même, i. e. les souris WT et cftr -/- ont reçu respectivement 1.5x106 et 0.5x106 cfu de la souche CHA pour l’infection ou un traitement avec respectivement 1.5x107 et 0.5x107 pfu du bactériophage P3-CHA, par voie intranasale dans les deux cas. Les souris infectées puis traitées ont reçu ce même traitement par bactériophages 2 h après l’infection.
Lors des mesures de ddp, quatre paramètres sont systématiquement étudiés : - la ddp basale (Basale)
- la réponse à l’amiloride (Amil.)
- la réponse à une perfusion pauvre en ions chlorure (LowCl-) - la réponse à un inhibiteur spécifique de CFTR (Inh-172)
Dans certaines conditions, le DIDS, un inhibiteur non spécifique des canaux chlorure hormis CFTR, est utilisé.
Deux mesures de ddp sont réalisées, chaque souris étant son propre contrôle :
- en dehors de tout traitement et au moins une semaine avant l’infection et/ou le traitement (J0)
- 16 h post-infection (infection ou infection + traitement) ou post-traitement par bactériophages seuls (T16)
Dans les trois conditions (infection, traitement, infection + traitement) et pour chaque paramètre de ddp (ddp basal, Amil., LowCl- et Inh-172), la différence entre les mesures J0 et T16 est évaluée pour chaque groupe de souris par le test des rangs signés de Wilcoxon (Wilc.).
D’autre part, les limites d’intervalles définissant la variabilité intra-animal de notre modèle (cf. Table 14 et article 2) ont été utilisées pour analyser ces résultats. Ainsi, lors de l’infection ou du traitement, si les différences entre deux mesures de ddp sont comprises entre ces limites dans 95 % des cas, alors elles seront attribuées à la variabilité intra-animal et non à
Résultats
a) Etude de souris WT
Pour le groupe de souris infectées comme pour le groupe uniquement traité par le bactériophage P3-CHA, aucune différence significative n’est observée entre les mesures réalisées avant l’infection/traitement et celles réalisées après, pour aucun des quatre paramètres de ddp étudiés (Wilc. p > 0.05). Dans chacun des cas, les valeurs de ddp obtenues sont semblables aux valeurs standards établies dans l’Article 2. Ces résultats sont illustrés dans la figure 33A. De plus, d’après la représentation de Bland-Altman, ces différences correspondent à la variabilité intra-animal (Table 15). En revanche, malgré des différences non significatives entres les mesures J0 et T16 (Wilc. p > 0.05), les souris du groupe infecté puis traité par le bactériophage P3-CHA présentent un transport du sodium semblant être légèrement altéré. En effet, entre les mesures J0 et T16 de ddp basale et Amil., plus de 35 % des souris montrent des différences non-inclues entre les limites standard de la variabilité intra-animal (Table 15). Parallèlement, les dénombrements dans les BAL de ces souris montrent que le traitement par P3-CHA a réduit le nombre de P. aeruginosa d’environ 1,5 log (Figure 33B). Ces résultats suggèrent que l’infection pulmonaire par la souche CHA et que le bactériophage P3-CHA, séparément, ne perturberaient pas de manière conséquente les transports du sodium et ni du chlorure.
Infection par CHA n= 14
Traitement par P3-CHA n = 13 Infection + Traitement n = 11 ddp basale ~ 95 ~ 95 ~ 65 Amil. ~ 95 100 ~ 65 LowCl 100 ~ 95 100
Table 15 : Analyse de la représentation de Bland et Altman pour 3 paramètres de ddp chez des souris WT infectées et/ou traitées
Sont exprimés, pour chaque cas, le pourcentage de souris dont les différences entre les mesures J0 et T16 sont inclues entre les limites standard définies. Ces limites ont étés établies
grâce à représentation de Bland-Altman réalisée en fonction de deux mesures répétées chez les mêmes souris, en dehors de tout traitement, et définissent la variabilité intra-animal dans notre modèle de mesure de ddp (Article 2). Lors de l’infection et/ou du traitement, les différences entre deux mesures de ddp seront attribuées à la variabilité intra-animal seulement si au moins 95 % d’entre elles sont comprises entre ces limites.
Figure 33 : Mesure de ddp dans 3 conditions d’infection pulmonaire et/ou traitement par bactériophages chez la souris WT
Une première mesure de ddp a été réalisée pour chacune des souris au minimum une semaine avant l’infection et / ou le traitement (•). Une mesure à ensuite été réalisée sur ces mêmes souris 16 h après l’infection (pour les souris infectées et les souris infectées puis traitées) ou après le traitement par P3-CHA seul (•). (A) La ddp basale, la réponse à l’amiloride et la réponse à la perfusion d’une solution pauvre en ions
Résultats
b) Etude d’un modèle murin de mucoviscidose
Les résultats obtenus chez les souris WT montrent que les bactériophages ne semblent pas perturber le transport ionique. Cependant, il est important de tester cette hypothèse dans un environnement CF, où les propriétés de l’épithélium sont différentes avec une absorption du sodium exagérée et une sécrétion du chlorure dépendante de CFTR inexistante. Les résultats de ddp obtenus chez la souris cftr -/-, montrent de la même manière que chez les souris WT, qu’une administration intranasale de 5x106 pfu du bactériophage P3-CHA n’affecte ni l’activité du canal ENaC ni le transport du chlorure alternatif à CFTR (Figure 34A ; Table 16 et 17).
En revanche, l’infection pulmonaire par 0.5x106 cfu de la souche CHA provoque, chez ces souris, une inhibition partielle significative de l’activité du canal ENaC (Figure 34A ; Table 17). Celle-ci ne peut pas être attribuée à la variabilité normale (Table 16). Les valeurs de ddp basale et du Amil. sont d’ailleurs diminuées par rapport aux valeurs standard décrites dans l’article 2, à savoir une valeur médiane de ddp basale de -15.9 mV (IQR = 7.6 mV) vs. -20.9 mV (IQR = 6.5) et une valeur médiane du Amil. de 6.6 mV (IQR = 5.7 mV) vs. 9.1 mV (IQR = 4.2 mV) (cf. Table 13). Cette altération de l’activité du canal ENaC n’est pas retrouvée dans le lot de souris ayant reçu une dose curative de bactériophages 2 h après l’infection. Ces résultats suggèrent que, dans un contexte CF, le traitement par bactériophages tend à éliminer les perturbations du transport du sodium causées par l’infection à
P. aeruginosa.
D’autre part le transport du chlorure semble stimulé par l’infection à P. aeruginosa (Figure 34). Cette stimulation est peu marquée et pourrait être attribuée à la variabilité normale (Table 16). Cependant, chez les souris infectées comme chez les souris infectées puis traitées, les valeurs entre les mesures J0 et T16 diffèrent significativement (Table 17). De plus, il est à noter que respectivement 46 % et 33 % de ces souris montrent une hyperpolarisation en réponse à la solution pauvre en chlorure de respectivement -2.4 mV (± 1.2 mV) et -3.1 mV (± 1.5 mV) en moyenne. Or, en dehors de toute infection, ce phénomène est observé chez seulement 18 % des souris cftr -/- et avec une amplitude moyenne de seulement -0.6 mV (± 0.5 mV) (n = 50). Il semble donc que l’infection par la souche CHA de P. aeruginosa stimule la sécrétion des ions chlorure, par des canaux alternatifs à CFTR. Cette hypothèse est renforcée par la valeur du DIDS, inhibiteur des canaux chlorure hormis CFTR, qui est significativement plus élevée chez les souris infectées puis traitées (Table 17 ; 6.6 mV (IQR = 4.6 mV) vs. 2.6 mV (IQR = 2.9 mV)).
Infection par CHA n= 13
Traitement par P3-CHA n = 14 Infection + Traitement n = 9 ddp basale ~ 70 ~ 95 100 Amil. ~ 75 100 ~ 90 LowCl ~ 95 ~ 95 ~ 90
Table 16 : Analyse de la représentation de Bland et Altman pour 3 paramètres de ddp chez des souris cftr-/- infectées et/ou traitées
Est exprimé, pour chaque cas, le pourcentage de souris dont les différences entre les mesures
J0 et T16 sont inclues entre les limites standards définies. Ces limites ont étés établies grâce à
représentation de Bland-Altman réalisée en fonction de deux mesures répétées chez les mêmes souris, en dehors de tout traitement, et définissent la variabilité intra-animal dans notre modèle de mesure de ddp (Article 2). Lors de l’infection et/ou du traitement, les différences entre deux mesures de ddp seront attribuées à la variabilité intra-animale seulement si au moins 95 % d’entre elles sont comprises entre ces limites.
Infection par CHA n= 13
Traitement par P3-CHA n = 14 Infection + Traitement n = 9 ddp basale ** (0.0052) ns ns Amil. * (0.0342) ns ns LowCl- * (0.0327) ns * (0.0273) Inh-172 ns ns ns DIDS nd ns * (0.0313)
Table 17 : Analyse des différences entre les mesures de ddp réalisées avant et après infection / traitement chez la souris cftr-/-
La différence entre les mesures de ddp réalisées avant l’infection et/ou le traitement (J0) et
celles réalisées après (T16) est évaluée, pour chaque paramètre de la mesure de ddp, par le
test des rangs signés de Wilcoxon (Wilc.). ns : non significatif ; * : p < 0.05 ; ** : p < 0.01 ; nd : non déterminé.
Figure 34 : Mesure de ddp dans 3 conditions d’infection pulmonaire et/ou traitement par bactériophages chez la souris cftr-/-
Une première mesure de ddp a été réalisée pour chacune des souris au minimum une semaine avant l’infection et / ou le traitement (•). Une mesure à ensuite été réalisée sur ces mêmes souris 16 h après l’infection (pour les souris infectées et les souris infectées puis traitées) ou après le traitement par P3-CHA seul (•). (A) La ddp basale, la réponse à l’amiloride et la réponse à la perfusion d’une solution pauvre en ions chlorure ont été mesurées. (B) Les bactéries et/ou les bactériophages ont été dénombrés dans les BAL de ces souris. Les données sont exprimées en médianes (± InterQuartile Range). * : p < 0,05 ; ns : non significatif, en comparaison avec l’infection seule ou le traitement seul (Test de Mann-Whitney.