L’analyse protéomique pour la découverte de biomarqueurs

En raison de l'abondance et de la diversité des protéines et la grande quantité de

l’information générée, la production, le traitement et l'interprétation des données

protéomiques est une tâche très complexe. Des échantillons de tissus de mammifères

contiennent entre 10 000 et 30 000 types de protéines différentes, d'où une large gamme de

technologies (Tableau 02) qui doit être utilisé en parallèle pour préparer, séparer et quantifier

les abondances des milliers de protéines (Mullen et al., 2009 ; Bendixen, 2005 ; 2013 ). Une

liste non exhaustive des approches protéomiques appliquées dans le domaine des viandes à la

recherche d’indicateurs de qualité est présentée dans le Tableau 02.

Initialement, l’électrophorèse, monodimensionnelle (Laemmli, 1976) puis

bidimensionnelle (2DE) après coloration simple au Bleu de Coomassie ou au nitrate d’argent

Figure 26. Evolution de l’utilisation de la protéomique.

Histogrammes montrant l’évolution du nombre de travaux scientifiques publiés durant la

période 2000 – 2014 et liés à l’application de la protéomique dans le domaine des viandes. Le

graph a été préparé en interrogeant le moteur de recherche bibliographique « Google

Scholar ». La requête a été effectuée le 15.04.2015 en utilisant comme mots clés

« Proteomic » ; « Protein » ; « Meat » et « Quality ».

0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000 3300 3600

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Année

a été utilisée dans l'étude du protéome. La 2DE fait intervenir deux paramètres de séparation,

le point isoélectrique (pI) et la masse moléculaire (O’Farrell, 1975 ; Jensen et al., 1998). La

séparation permet l’amélioration de la résolution du fractionnement des mélanges de protéines

complexes, et permet ainsi aux différentes protéines d'être séparées. La DiGE pour Difference

Gel Electrophoresis, a été mise au point pour palier aux inconvénients liés aux réplicats

techniques de la comparaison de gels 2DE, une technique assez proche mais utilisant des

fluorochromes, les cyanines (Unlu et al., 1997 ; Viswanathan et al., 2006). Deux ou trois

échantillons de protéines différents sont marqués avec des colorants fluorescents avant la

séparation. Ceci permet une analyse plus précise et poussée des différences dans l'abondance

des protéines entre échantillons.

Bien que très utilisée, l’analyse 2DE présente quelques limites pour lesquelles l’opérateur

doit rester prudent, par exemple, la co-migration des protéines et la mauvaise résolution et

séparation des protéines basiques et hydrophobes. De plus, les protéines faiblement

concentrées sont difficiles à étudier et ne sont souvent pas révélées par les colorations

classiques (Gygi et al., 2000). Un autre inconvénient de l'analyse 2DE est que lorsqu'elle est

appliquée à des échantillons complexes non fractionnés, la surface limitée du gel ne permet

d’analyser que les protéines les plus abondantes (Pedersen et al., 2003). De ce fait, le

pré-fractionnement d'échantillons complexes peut être appliqué pour contourner ce problème

(Gorg et al., 2002; Spandidos et Rabbitts, 2002).

La caractérisation et l’identification des spots d’intérêt font aussi appel à d’autres

techniques d’identification, appelées communément la spectrométrie de masse (MS)

(Malmstrom et al., 2007). Deux principales applications de la MS ont vu le jour dans les

études protéomiques. La première est l'identification des spots de protéines à partir d’un gel

2DE ou directement des extraits protéiques et la deuxième est la protéomique comparative.

Les technologies de MS les plus utilisées pour l'identification des protéines sont l'ionisation

électrospray (ESI) (Fenn et al., 1989) et le MALDI (Matrix Assisted Laser

Desorption/Ionization) (Hillenkamp et al., 1991). Le MALDI peut être combiné avec un

analyseur de masse en temps de vol (TOF pour time-of-flight). Cette technologie est idéale

pour analyser les empreintes peptidiques massiques (PMF), de protéines digérées par

protéolyse, par exemple, digestion trypsique. Les spectres des peptides ne sont pas

quantitatifs, mais qualitatifs, vu que les capacités d'ionisation des peptides ne sont pas

visualisables (Lim et al., 2003). Une analyse in silico, par comparaison aux bases de données

d’empreinte peptidiques est effectuée.

Figure 27. Principe des biopuces à protéines (Anton Leberre, 2013).

La molécule-partenaire est marquée à l’aide d’un fluorophore. Une fois les molécules mises

en contact avec la biopuce, les complexes formés émettront une fluorescence détectable. La

lecture des spots sera alors réalisée par un scanner et analysée par un logiciel qui va traduire

ces signaux en informations représentatives de l’abondance relative des protéines. Les

fluorophores les plus utilisés sont des dérivés de la cyanine solubles dans l’eau qui émettent à

des longueurs d’onde comprises entre 500 et 650 nm. Une seconde approche, connue sous le

terme de « sandwich », présente l’avantage de ne pas perturber la structure de la

molécule-partenaire et augmente de ce fait l’intensité du signal. Dans ce cas, l’interaction entre les

molécules partenaires est détectée par un anticorps marqué.

Comme alternative, de nouvelles autres technologies se caractérisant par une vitesse et

sensibilité très élevées ont été proposées et appliquées pour remédier aux défauts de la 2DE

seule. Nous citons le SELDI-TOF (Surface-Enhanced Laser

Desorption/Ionization-time-of-flight) (Marcos et al., 2013a,b) ; XIC-based (Extracted Ion Currents) (Bauchart et al., 2006) ;

nLC-MS/MS (nanoliquid chromatography-tandem mass spectrometry) (Gallego et al.,

2015) ; LESA-MS (Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry) (Montowska et

al., 2014a,b) et iTRAQ (isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification) (Ross et al.,

2004 ; Ernoult et al., 2008). Pour la majorité de ces techniques, la quantification est très

spécifique avec une très haute répétabilité. En outre, le fractionnement par la méthode

OFF-GEL est une autre alternative qui séduit un bon nombre de laboratoires. Elle est de plus en

plus appliquée dans le domaine des viandes (Sentandreu et al., 2010 ; Surowiec et al., 2011 ;

Fernandez et al., 2015). Cette méthode est basée sur une séparation de molécules amphotères,

en fonction de leur pI, dans un gradient de pH soumis à un champ électrique (Ros et al.,

2002). L’évolution de ces technologies protéomiques ainsi que leurs applications dans les

sciences de la viande ne cessent de croître. La Figure 26, en interrogeant le moteur de

recherche Google Scholar illustre cette évolution croissante depuis le début de l’année 2000.

Enfin, certains laboratoires s’intéressent aujourd’hui aux puces à protéines (biopuces), qui

sont des technologies extrêmement sensibles pour l’analyse du protéome. Les biopuces sont

des systèmes miniaturisés permettant des analyses sur un grand nombre d’échantillon et à

haut débit (Figure 27). Les biopuces sont très utiles dans l'étude des interactions entre

biomolécules et les réflexions pour leur utilisation dans le domaine de la viande est d’actualité

Cette technologie, qui est en pleine émergence, offre l’avantage de pouvoir comparer et

caractériser simultanément un grand nombre de cibles protéiques (Sakanyan, 2004). Elles

impliquent l'utilisation d'une sonde qui est spécifique pour un analyte particulier, placé à la

surface de la puce à une position définie. Les principes de base ont été largement documentés

par Elkins et al. (1989) et illustrés dans la Figure 27. Toutefois, l'application de puces à

protéines pour la protéomique n’est pas très avancée par rapport à celle des puces à ADN.

Bien que très efficace, cette technologie a des limites. En particulier, les protéines

sous-exprimées peuvent ne pas être révélées. D’autre part, des changements affectant les niveaux

d’abondances relatives des protéines peuvent impliquer des peptides à faible abondance (Celis

et al., 2000). Par conséquent, la technologie des biopuces peut être avantageuse dans ce cas.

La finalité de nos recherches actuelles sur l’indentification des biomarqueurs des qualités de

viandes est la mise en place d’une biopuce à protéines pour des analyses en routine.

Chapitre IV Revue de littérature

IV.5. Applications des technologies de la protéomique à l’étude du protéome de la