Les kinases senseurs NarX et NarQ

Chez E. coli, les gènes codants les systèmes NarX-NarL et NarQ-NarP sont situés sur trois loci différents. narX et narL sont codés en opéron alors que narQ et narP sont des gènes codés indépendamments à des loci distants de presque 300 kb.

Les kinases NarX et NarQ sont des paralogues c’est-à-dire que la séquence de ces deux protéines a divergé après une duplication. De façon intéressante on ne trouve que chez E. coli et chez S. enterica à la fois narX et narQ associés à narL et narP (Stewart 2003). Dans les autres génomes séquencés on ne retrouve qu’une seule version de la kinase sensible aux nitrates. Par homologie de séquence et conservation de la synténie il est possible de préciser si l’organisme possède une kinase de type « NarX » ou de type « NarQ ». Par exemple, chez Vibrio cholerae ou Yersinia pestis n’est présent que narQ alors que chez chez Pseudomonas aeruginosa on ne retrouve que narX. La présence simultanée de NarQ et de NarX a donc beaucoup été étudiée et a pu mettre en évidence le rôle subtil de ces deux kinases mais aussi leurs caractéristiques communes.

1.2.6.3.1. Caractéristiques communes

NarX et NarQ sont deux protéines associées à la membrane de 598 et 566 acides aminés respectivement. Elles possèdent une topologie similaire à savoir deux hélices transmembranaires délimitant le domaine N-terminal périplasmique essentiel à la perception du signal et relié au domaine cytoplasmique par un linker.

Leurs séquences en acides aminés partagent 32 % d’identité, essentiellement localisée dans 4 « motifs » de la région cytoplasmique et un « motif » de la région périplasmique. La séquence périplasmique conservée nommée « boite P » est constituée de 18 acides aminés consécutifs dont 15 sont identiques (Chiang, Cavicchioli et al. 1992). Cette région étant unique à NarX et à NarQ, il a été proposé qu’elle soit à l’origine de la reconnaissance des nitrates. La partie cytoplasmique contient quant à elle trois domaines (H, N et G1) retrouvés chez d’autres systèmes à deux composants et un domaine « C » spécifique à NarX et NarQ (figure 36). Le domaine H porte notamment le site d’autophosphorylation à savoir le résidu histidine 399 pour NarX et histidine 370 pour NarQ. Sont également conservés une seconde histidine (NarX His-513 et NarQ His-484) et une asparagine (NarX Asn-509 et NarQ Asn-480) toutes deux essentielles à la transmission du phosphate au régulateur NarL (Cavicchioli, Schroder et al. 1995) et potentiellement au régulateur

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65 NarP (non testé cependant). On peut noter que ces deux résidus sont séparés de quatre acides aminés ce qui est une caractéristique de la famille des kinases senseurs de type UhpB (Chiang, Cavicchioli et al. 1992).

Figure 36 : Représentation schématique des protéines NarX et NarQ et de leurs domaines conservés. Les deux senseurs sont alignés par rapport à leur extrémité N-terminale (+1). En noir sont représentés les segments transmembranaires hydrophobes de 20 à 22 acides aminés de long. Les régions conservées avec les autres systèmes à deux composants à savoir les régions H, N et G1 sont indiquées en vert. Les régions conservées cytoplasmique (C) ou périplasmique (P) uniques aux protéines NarX et NarP sont représentées par des zones hachurées. La position des acides aminés conservés est également mentionnée.

1.2.6.3.2. Perception du signal

Il a été montré que la protéine NarQ reconnaissait de façon équivalente les nitrates et les nitrites alors que NarX avait une affinité différentielle pour ces deux ligands avec une préférence marquée pour les nitrates (Lee, Delgado et al. 1999). Cette différenciation serait due aux deux acides aminés (His-45 et Lys-49) de la boite P de NarX différents de la boite P de NarQ (Williams and Stewart 1997). En effet, une mutation du résidu Lys-49 de narX a comme conséquence d’obtenir un phénotype narQ+ à savoir qu’il n’y a plus de discrimination entre nitrite et nitrate dans une souche délétée pour narQ par ailleurs. Par ailleurs, une double mutation His-45/Lys-49 conduit à une insensibilité aux nitrites in vivo. Si ces résidus essentiels à la fonction de NarX sont mutés dans la séquence de narQ (ce qui correspond aux résidus Glu-41 et Arg-55) cela n’a aucun effet ce qui confirme la spécificité du senseur NarX.

Par ailleurs si l’histidine 45 et la lysine 49 semblent essentielles pour la discrimination entre nitrates et nitrites, ils ne sont a priori pas le site de fixation de ces ligands. En effet, le résidu critique serait l’arginine 54. Une étude a pu montrer qu’une mutation de ce résidu avait pour conséquence de rendre insensible NarX à la présence de nitrate ou de nitrite, laissant celle-ci bloquée dans un stade « activité phosphatase seule » (Cavicchioli, Schroder et al. 1995). Une

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mutation du résidu Arg-50 de NarQ (qui correspond à l’Arg-54 de NarX) donne également un phénotype d’insensibilité (Chiang, Cavicchioli et al. 1997).

La structure cristallographique du domaine senseur de NarX en complexe avec du nitrate a pu confirmer l’importance des résidus de la boite P et en particulier l’arginine 54. Elle a pu également préciser la structure du site de fixation du ligand (Cheung and Hendrickson 2009) à savoir que le nitrate se localise au milieu de deux dimères de NarX (figure 37). Très récemment, la structure cristallographique des domaines senseurs, transmembranaires et cytoplasmiques de NarQ a été résolue (Gushchin, Melnikov et al. 2017). Cette étude a pu mettre en évidence que la fixation des ligands (nitrate/nitrites) induisait des changements conformationnels significatifs responsables de la transduction du signal.

Figure 37 : Structure du domaine senseur de NarX à 1.7Å. La structure permet de mettre en évidence la localisation du nitrate entre les deux dimères de NarX (A) et plus précisément au niveau des boites P (en rouge sur la représentation du squelette carboné en B). Le nitrate établit des liaisons hydrogène avec les résidus N54, N48 des deux monomères de NarX ainsi qu’une molécule d’eau (C). Issue de (Cheung and Hendrickson 2009).

Un modèle propose qu’en présence de nitrate ou de nitrite dans le périplasme, ces derniers vont interagir avec les acides aminés de la boite P de NarX ou NarQ (Chiang, Cavicchioli et al. 1997). Cette interaction aura pour effet d’engendrer un changement conformationnel du domaine périplasmique qui à la suite conduira à un changement conformationnel du domaine cytoplasmique des deux protéines. Ce dernier changement permettra aux protéines NarX et NarQ de passer d’un mode « OFF » à un mode « ON » leur permettant de s’autophosphoryler sur leur résidu histidine

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67 (His-399 pour NarX et His-370 pour NarQ) et transmettre leur phosphate aux régulateurs. La mutation de l’arginine 54 de narX a pour conséquence de conserver la protéine dans un mode « OFF ». En revanche une mutation de l’histidine 45 en proline conserve la protéine dans un mode « ON ».

Enfin, l’activité autokinase de NarX est 100 fois plus sensible à la présence de nitrates que de nitrites (Lee, Delgado et al. 1999). En effet, l’autophosphorylation de NarX in vitro apparait à un seuil en nitrate de 5µM (50% d’autophosphorylation à 35 µM). En présence de nitrite le seuil est de 500 µM (50% autophosphorylation à 3,5 mM).

En conclusion, NarX a un seuil de détection relativement différent entre les nitrites et les nitrates ce qui est probablement dû à la nature des acides aminés présents dans la boite P.

1.2.6.3.3. Affinité différente pour les régulateurs

Une fois que les kinases NarX et NarQ se sont autophosphorylées sur leur résidu histidine elles peuvent transmettre le phosphate au régulateur qui leur est associé. Cependant, la régulation croisée entre ces deux systèmes obéit à des règles bien particulières (figure 38).

Figure 38 : Modèle de régulation croisée asymétrique pour les systèmes à deux composants NarX-NarL et NarQ-NarP. Alors que NarQ ne présente pas de préférence pour la phosphorylation des deux régulateurs, NarX phosphoryle préférentiellement NarL.

Des études avec des mutants nuls montrent que, seuls, NarX ou NarQ ne sont pas suffisants pour obtenir une réponse au nitrate normale vis-à-vis des opérons NarL-dépendants (Rabin and Stewart 1992). En revanche, NarX seul permet d’avoir un phénotype sauvage pour les gènes NarP- dépendants en absence de NarL (Rabin and Stewart 1993). Une étude en 2009 a permis de mieux comprendre le lien entre ces deux systèmes et d’expliquer l’intérêt de la redondance. En effet, il a

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pu être montré que NarX avait une préférence cinétique pour la phosphorylation de NarL par rapport à celle de NarP (figure 38). En revanche NarQ montre une cinétique de phosphorylation semblable vis-à-vis des deux régulateurs (Noriega, Lin et al. 2010). Une étude plus récente a précisé que ces préférences cinétiques seraient liées à des affinités différentes dans les couples senseurs-régulateurs (Huynh, Chen et al. 2015).

Enfin, en présence de nitrite, NarX se comporte de façon prédominante comme une phosphatase pour NarL ce qui a pour conséquence d’avoir un faible niveau de forme phosphorylée de NarL et donc une faible activation des promoteurs NarL-dépendants (Rabin and Stewart 1993).

Nous pouvons donc conclure que NarX semble être un senseur relativement spécialisé répondant de façon différente aux nitrites et aux nitrates et ayant une préférence pour le régulateur NarL. A l’inverse, NarQ semble être plus généraliste n’exerçant à priori aucune préférence de ligand ou de régulateur associé.