Interaction protéines-acides ribonucléiques : Immunoprécipitation de l’ARN (RNA-IP)

Principe : Cette technique permet d’analyser l’interaction entre une protéine et un ARN

spécifique. Le principe de la méthode repose sur 1) la création de liaisons covalentes in vivo

entre les protéines et l’ARN grâce à un agent de pontage (le formaldehyde), 2) la libération

des complexes associés à la chromatine et fragmentation modérée des ARN par sonication,

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3) une digestion de l’ADN, 4) l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt via un anticorps

spécifique, 5) la purification des ARN, et 6) l'analyse des ARN par RT-qPCR.

Préparation et fixation des culots de cellules : 50mL de cellules sont cultivées en milieu YEA

à 30°C jusqu’à une DO600 de 1.2 à 1.5 (phase exponentielle de croissance) et fixées par 1%

(p/v) de formaldéhyde pendant 15min sous agitation à température ambiante. Le

formaldéhyde est ensuite neutralisé par ajout de glycine à une concentration finale de

0.125M sous agitation 5min à température ambiante. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois

avec 20mL de tampon TBS froid (Tris Buffered Saline : Tris-HCL pH=7.6 20mM, NaCl 150mM)

et centrifugées 5min à 800g à 4°C puis congelées instantanément dans de l’azote liquide. Les

culots ainsi préparés peuvent être conservés plusieurs mois à -80°C.

Lyse et sonication des cellules : Le culot de cellules est remis en suspension dans 400µL de

tampon de lyse froid (HEPES-NaOH pH=7.5 50mM, NaCL 150mM, EDTA 1mM, Triton X-100

1% (p/v), sodium deoxycholate 0.1% (p/v), DTT 5mM, PMSF 1mM, Ribolock 100U/ml

(Thermo Scientist) auquel est rajouté 1.2mL de billes de verres, puis les cellules sont broyées

grâce au Bead-beater avec 4 cycles de lyse de 1min30 et 2 minutes de refroidissement sur

glace entre chaque cycle. Le fond des tubes est ensuite percé avec une aiguille de diamètre

inférieur à celui des billes de verre et le lysat est récupéré par centrifugation 5 min à 800g.

Une sonication est réalisée par 6 cycles successifs de 30 secondes de sonication à 240W et

30 secondes de refroidissement (Bioruptor, Diagenode). Les débris cellulaires sont ensuite

éliminés par 10 min de centrifugation à 16000g à 4°C.

Traitement à la DNAseI : Le traitement à la DNAseI permet de se débarrasser de l’ADN

génomique présent dans le lysat de cellules. Il est indispensable pour précipiter l’ARN

spécifiquement associé aux protéines (et non ceux précipités par le biais d’un ADN). A 400µL

de lysats de cellules sont ajoutés 50µL de tampon DNAse 10X (250mM MgCl2, 50mM Cacl2),

et 50µL de tampon de lyse contenant 700U de DNAse I (RNAse free, from Bovine Pancreas,

Sigma). Le mélange est ensuite incubé 1h à 30°C puis la réaction est stoppée par ajout de

20mM final EDTA. L’échantillon est clarifié par 10 minutes de centrifugation à 16000g à 4°C.

50µL d’échantillons sont mis de côté et congelés à -20°C pour servir de contrôle de charge

(Input). Le reste de l’échantillon est utilisé pour l’immunoprécipitation.

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Immunoprécipitation : La précipitation de la protéine Rrp6-13Myc est réalisée avec 0.35µg

d’anticorps anti-myc 9E10 (0.35% p/p ; souris ; Covance Réf : MMS-150P ; 0.7mg/mL) pour

1µg de protéines totales (quantité estimée par dosage Bradford, Biorad). Le mélange est

incubé 2h à 4°C sous agitation orbitale (13rpm). En parallèle un échantillon identique est

incubé sans anticorps et sera utilisé pour déterminer le bruit de fond dû à la fixation

résiduelle des ARN/protéines sur les billes. Le complexe ARN-protéine-anticorps est ensuite

précipité par ajout de 20µL de billes de sépharose couplées à la protéine A (4 Fast Flow, GE

Healthcare) préalablement lavées 3 fois dans du tampon de lyse. Pour les précipitations des

protéines étiquetées avec l’étiquette TAP (Cti1-TAP, Mmi1-TAP, Rrp6-TAP), les échantillons

sont incubés avec 20µL de billes de sépharose couplées aux immunoglobulines G (Flow, GE

Healthcare) qui s’associent avec la protéine A de l’étiquette TAP. Après

immunoprécipitation, la sépharose (soit couplée à la protéine A, soit couplée aux IgG) est

lavée 2 fois 5 min à température ambiante et sous agitation douce dans 1mL de tampon de

lyse contenant 10U d’inhibiteur de RNAse (Ribolock) puis centrifugée à 200g à 4°C. Les billes

sont ensuite lavées de la même manière dans 1mL de Tampon de Lyse contenant 500mM

NaCl (HEPES-NaOH pH=7.5 50mM, NaCl 500mM, EDTA 1mM, Triton X-100 1% (p/v), sodium

deoxycholate 0.1% (p/v), DTT 5mM, PMSF 1mM, Inhibiteur de RNAse Ribolock 100U/ml),

1ml de tampon de lavage (Tris-HCL pH8 10mM, LiCL 0.25M, NP-40 0.5% (p/v), sodium

deoxycholate 0.5% (p/v), EDTA 1mM, DTT 5mM, Ribolock 10U/mL) puis dans 1mL de tampon

TE 1X (Tris-HCL pH8 10mM, EDTA 1mM, DTT 5mM, Ribolock 10U/mL).

Les complexes ARN-protéines sont ensuite élués par ajout de 100µL de tampon

d’élution (Tris-HCL pH8 50mM, EDTA 10mM, SDS 1% (p/v), DTT 5mM, Ribolock 10U/mL) et

incubation 20 min à 65°C. Après 30 secondes de centrifugation à 12000g, l’éluât est

récupéré. Les billes sont alors mises en présence de 150µL de tampon TES-DTT (Tris-HCL pH8

10mM, EDTA 1mM, SDS 0.67% (p/v), DTT 5mM, Ribolock 10 U/mL) et le surnagent récupéré

est ajouté aux 100µL d’éluat précèdent. 200µl de tampon TES (Tris-HCL pH8 10mM, EDTA

1mM, SDS 0.67% (p/v), Ribolock 10 U/mL) sont ajoutés aux 500µL d’échantillons

préalablement mis de côté pour le contrôle de charge (Input) après le traitement à la

DNAseI. Les échantillons (Input, échantillons immunoprécipités avec anticorps, échantillons

sans anticorps) seront ensuite tous traités de manière identique et sont incubés de 4h à 15h

à 65°C pour casser le pontage chimique au formaldéhyde.

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Purification des ARN : La digestion des protéines est réalisée par l’ajout de 200µl de tampon

TE 1X + 5mM DTT, 10U/mL Ribolock et 100µg de protéinase K (Roche). Le tout est incubé 30

min à 65°C. Les ARN sont ensuite purifiés par ajout d’un volume de phénol-chloroforme

acide (Solution 5-1 ; pH4.5 Ambion) et 1/10^ème de volume d'acétate de sodium [3M pH5.2,

centrifugés 5min 16000g à 4°C. Le surnageant est prélevé puis additionné d'un volume de

chloroforme et 1/10^ème de volume d'acétate de sodium 3M pH5.2. Après centrifugation, la

phase aqueuse est récupérée et les ARN sont ensuite précipités par ajout de 3 volume

d’éthanol 100% et 1µg de glycogène, et incubation 30 minute à -80°C. Après 30 minutes de

centrifugation à 16000g, les culots sont lavés une fois à l’éthanol 75%, et resuspendus dans

13µL de Tampon TE1X contenant du DTT 5mM et 10U/mL de Ribolock.

Analyse de l’ARN par RT-qPCR : 6µl d’ARN purifiés de la RNA-IP sont traités à la DNase (15

minutes) et sont "reverse transcrits" en utilisant des amorces spécifiques (voir chapitre 6.2).

Les cDNA sont ensuite dilués au ¼ et la qPCR est réalisée dans les mêmes conditions que

celles décrites dans le chapitre 6.2.3.

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Chapitre I : Contrôle de la terminaison de