Informations génétiques

2.3.2.3.1. Prélèvements biologiques et extraction d’ADN

Les participantes à l’étude de cohorte prospective furent recrutées au CHU de Québec d’avril 2005 à mars 2010 durant leur première visite prénatale (Forest et al. 2014). Les échantillons biologiques de la mère et de l’enfant furent prélevés lors des visites d’échographie, à l’amniocentèse ou à l’accouchement par des prélèvements sanguins sur la mère et sur le cordon ombilical à l’accouchement afin d’obtenir les caractéristiques génétiques de l’enfant.

Les échantillons sanguins ont été collectés dans des tubes contenant l’anticoagulant EDTA puis ils ont été centrifugés 2 h après le prélèvement avant d’être conservés à -80 °C. L’ADN a été extrait des échantillons par le Kit QIAamp DNA Blood (Qiagen) selon le protocole recommandé par le manufacturier. Les extraits d’ADN sanguin furent conservés à -20 °C pour les analyses ultérieures.

Les échantillons salivaires des mères et de leur enfant furent prélevés à l’aide du kit ORAGENE-DNA (OG-500 et OG 575 ; GENOTEK, Kanata, ON, Canada). Le matériel et les directives d’échantillonnage recommandées par le manufacturier furent envoyés par courrier postal aux participantes potentielles. Une fois les prélèvements effectués, ils furent renvoyés à l’équipe de recherche par courrier prépayé. L’extraction de l’ADN salivaire fut réalisée selon le protocole de Genotek avec des adaptations mineures. Les échantillons d’ADN salivaire furent également conservés à -20 °C.

Le protocole de recherche a été soumis à des procédures éthiques, les échantillons et les données génétiques ont été anonymisés et traités dans la confidentialité. La participation à l’étude était volontaire et le droit de retrait était évoqué dans les formulaires de consentement (Annexe 5). L’étude initiale (Levallois et al., 2012) ainsi que les amendements apportés par ajout des données génétiques provenant de l’ADN salivaire et de l’ADN sanguin de la cohorte (Giguère et al., 2015) ont été réapprouvés par le comité d’éthique et de la recherche

du CHU de Québec-Université Laval lors d’une réunion plénière tenue le 10 décembre 2015. La présente étude a été exemptée des procédures éthiques par le comité d’éthique de la recherche avec des êtres humains de l’Université Laval (CÉRUL). En effet, puisque notre étude s’intégrait dans un projet plus large qui a été approuvé par le Comité d’éthique de la recherche du CHU de Québec-Université Laval, notre étude ne nécessitait pas d'obtenir une approbation éthique selon l’Énoncé de la politique des trois Conseils.

2.3.2.3.2 Sélection des polymorphismes nucléotidiques (SNPs) des gènes d’intérêts

À l’aide de l’outil Tagger (https://www.broadinstitute.org/mpg/tagger/), les SNPs marqueurs (tag SNPs) furent sélectionnés de sorte à capturer la diversité génétique des locus (gènes) d’intérêts. Un seuil de déséquilibre de liaison (r2_{) de 0,8 fut considéré ainsi qu’une}

fréquence de l’allèle mineur d’au moins 5 % (basée sur un échantillon d’une population caucasienne du projet 1000 Génomes (Phase I, avril 2012) provenant de la Grande-Bretagne, de la Toscane en Italie, de l’Utah d’origine occidentale et de l’Europe du Nord. Le choix des fréquences de l’allèle mineur à un seuil de 5 % est dû aux faibles puissances statistiques qu’engendrent des fréquences inférieures à ce seuil. Le SNP rs743572 du gène CYP17A1 rapporté dans l’étude de Yamada et al. (2004) ainsi que le SNP rs3892097 du gène CYP2D6 rapporté dans l’étude de Backer et al. (2008) ont également été sélectionnés pour le génotypage.

2.3.2.3.3. Génotypage des polymorphismes nucléotidiques (SNPs) des gènes d’intérêt

Le génotypage des SNPs fut réalisé à la plateforme de génotypage du CHU de Québec- Université Laval. Le protocole de génotypage suit les procédures suivantes :

• Quantification de l’ADN (QuantiFluor DNA)

Les concentrations d’ADN des échantillons salivaires et sanguins ont été déterminées par le système QuantiFluor dsDNA de Promega. Une concentration connue d’ADN a été diluée en série dans un tampon TE (10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) afin de préparer des solutions étalons servant au dosage de l’ADN par un spectrofluorimètre. Un aliquot de 25 µL de chaque solution étalon soit 2 µl de chacune des solutions étalons diluées dans 23 µL de tampon TE fut introduit dans chacun des 384 puits d’une microplaquette (Corning) et porté à un volume total de 50 µL en ajoutant 25 µL de QuantiFluor dilué 1:200. Le signal de fluorescence de l’échantillon a été mesuré à 485 nm d’excitation et 535 nm d’émission. La concentration d’ADN dans chaque échantillon fut déterminée grâce à la courbe d’étalonnage issue des mesures de fluorescence de chaque solution étalon.

• Génotypage (Sequenom MassArray system)

Les SNPs furent génotypés par la technologie Sequenom MassARRAY SNP Multiplex. Cette technologie a pour avantage d’être peu restrictive sur le type de SNP à analyser et son niveau de multiplexage élevé permet l’analyse en parallèle de 36 à 40 SNPs sur le même échantillon d’ADN.

La réaction de génotypage est initialement basée sur une PCR multiplex. Cette Technique PCR (polymerase chain reaction) requiert plusieurs couples d’amorces amplifiant simultanément plusieurs cibles d’ADN (SNPs) en une seule réaction PCR. Le choix des couples d’amorces encadrant la région contenant les SNPs d’intérêt fut réalisé par le logiciel MassArray Designer (Sequenom, www.mysequenom.com/tools). Les analyses multiplex ont été réalisées en utilisant le logiciel AssayDesigner (Sequenom, San Diego, CA). La PCR multiplex est suivie d’une réaction iPLEX consistant à l’extension en simple base des différentes amorces adjacentes à chaque SNP dirigée par une sonde (template-directed single base extension - SBE). Les produits finaux d’extension iPLEX ont été ensuite séparés et

détectés par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Sequenom). Le protocole détaillé de la méthode MassARRAY SNP Multiplex est le suivant :

Les réactifs de la PCR ont été ajoutés dans 384 puits d’une microplaque. Les réactifs d’un volume total de 5 µL étaient constitués de 30 ng d’ADN génomique, de 1 unité du HotStar Taq (Qiagen, Valencia, CA) contenant de l’ADN polymérase, de 4 mM de MgCl2 jouant le

rôle de catalyseur, de 500 µM des désoxyribonucléotides (dNTP) et 100 nM de chaque amorce PCR. L’amplification PCR a été réalisée selon les conditions de chauffage suivantes: 94°C durant 15 min pour la dénaturation initiale de l’ADN, 45 cycles à 94°C durant 20 sec pour la phase de dénaturation, 56°C durant 30 sec pour la phase d’hybridation ou appariement des amorces, 72°C durant 1min puis 72°C durant 5 min pour la phase d’élongation des amorces.

Les produits de la PCR ont subi un traitement SAP (shrimp alkaline phosphatase) dans le but de déphosphoryler les dNTP et les amorces PCR non utilisés. Les produits de la PCR ont ainsi été traités en ajoutant 0,5 unité de SAP (Sequenom) dans chaque puits. Pour la réaction iPlex, les réactifs ont été incubées à 37 °C durant 40 minutes et l’enzyme ADN polymérase a été activée sous incubation additionnelle à 85 °C pendant 5 min. Les amorces allongées précédemment obtenues en PCR multiplex ont été ajoutés au mélange iPlex pour une extension simple base par un cycle PCR sous les conditions suivantes : 94 °C pour 30 sec, 40 cycles (94 °C durant 5 sec suivit de 5 cycles de 52 °C durant 5 sec et 80 °C pour 5 sec), et 72 °C pour 3 min. Afin d’éliminer les sels contaminant les produits de la réaction iPlex, ceux-ci ont été dessalés à l’aide d’une résine. Les échantillons ont été ainsi dilués avec 25 µl d’eau et ajoutés à 6 mg de résine. La réaction finale a été arrêtée sur un SpectroChip (Sequenom) et les données ont été traitées par un spectromètre de masse compact par le MassArray Workstation (Sequenom). Des tracés en grappe de tous les SNPs ont été réalisés afin de vérifier la qualité des données. Les SNPs dont le génotypage a échoué ont été exclus incluant le SNP rs3892097 du gène CYP2D6. De façon générale, 9 SNPs ont été génotypés.