Influence des autres paramètres

Distance perfusée

Faire varier la distance perfusée d_{f l} – en modifiant la durée de l’écoulement – permet de

mettre en évidence la présence éventuelle d’un phénomène de lavage, et donc d’une durée

op-timale d’écoulement. En effet, nous avons pu observer au paragraphe précédent que, sous l’action

du fluide, une quantité importante de cellules est retrouvée dans la partie aval du montage. Si cette

proportion augmente avec la durée d’écoulement, nous pourrons en déduire que les cellules,

entraî-nées par le fluide, pénètrent l’échantillon, puis le traversent complètement. Il serait alors possible

de déterminer une durée optimale d’écoulement, ou de mettre au point des cycles d’écoulement en

allers-retours, pour maintenir les cellules au cœur de l’échantillon.

D’un point de vue physique, augmenter la durée du flux revient à moduler le travail transmis

aux cellules sans modifier l’intensité de la force qui leur est appliquée. Un changement du taux de

viabilité lié à ce paramètre nous indiquerait donc que l’énergie mécanique transmise aux cellules

est suffisamment élevée pour compromettre leur bon fonctionnement.

FIGURE 3.8 – Influence de la distance perfuséed_{f l}sur la colonisation cellulaire du biomatériau. A) : Fraction de

cellules ensemencée (vitesse :3.17et9.7×10⁻4m.s⁻1,1million de cellules par échantillon). B) : Taux de viabilité

des cellules. Les tests sont réalisés en flux continu,30 minutes après l’injection des cellules dans le montage. Les

barres d’erreur correspondent à l’écart type des données mesurées.

Sur la figure 3.8, on a représenté les résultats obtenus en faisant varier la distance perfusée pour

deux vitesses moyennes d’écoulement. Aucune tendance claire ne se dégage de ces données, que ce

soit à "haut" ou "bas" débit. Dans les plages de valeurs étudiées, ce paramètre ne semble donc pas

influer sur le comportement cellulaire au sein des échantillons. De plus, l’absence d’évolution de la

quantité de cellules ensemencées laisse présager une mauvaise pénétration dans le biomatériau. Ce

point devra être confirmé par la réalisation de coupes histologiques présentées dans le paragraphe

3.3.

Temps de pause

Au moment où elles pénètrent dans le dispositif, les cellules ont déjà subi de multiples facteurs

de stress, physiques et chimiques. Elles ont en effet été soumises à une action enzymatique, puis

centrifugées, et ont donc passé un certain temps à température ambiante (et non à37˚C), puis ont

été injectées à l’aide d’une seringue. On peut alors se demander si l’augmentation de la mortalité

observée après l’écoulement ne viendrait pas du stress supplémentaire que ce dernier occasionne

et qui, même s’il est a priorinon délétère pour les cellules, pourrait endommager une structure

cellulaire déjà éprouvée. Nous avons donc essayé d’observer des temps de pause plus ou moins

longs entre l’injection des cellules dans le dispositif et la mise en mouvement du fluide, pour

limiter l’accumulation des sollicitations ressenties par ces dernières. Les résultats de ces tests sont

présentés figure 3.9.

FIGURE3.9 – Influence du temps de pause avant l’écoulement sur la colonisation. A) : Fraction de cellules

ensemen-cées (vitesse :9.7×10⁻4m.s⁻1, distance perfusée :1.8cm, densité cellulaire : 1 million). B) : Taux de viabilité des

cellules. Les tests sont réalisés en flux continu. Les barres d’erreur correspondent à l’écart type des données mesurées.

Cette fois encore, aucune évolution n’est constatée en ce qui concerne la fraction de cellules

ensemencées ou leur taux de viabilité. L’ensemencement cellulaire semble donc insensible à ce

paramètre.

Vitesse du fluide

Intéressons-nous enfin au dernier paramètre de cette étude : la vitesse moyenne d’écoulement

du fluide −→

Vin, imposée en entrée du dispositif, qui est directement reliée aux efforts subis par les

cellules. En effet, en reprenant la loi de Poiseuille, tous les autres paramètres étant des

carac-téristiques fixes du système, le débit – et donc la vitesse moyenne du fluide – sont directement

proportionnels au gradient de pression existant au niveau de l’échantillon, et donc à la force de

pression s’appliquant sur les cellules. Notons qu’au voisinage de ces dernières, les effets dus aux

cisaillements locaux, qui nécessitent la connaissance du champ de vitesses local, s’ajoutent aux

effets de pression. Ces efforts mécaniques sont susceptibles de déformer la membrane cellulaire.

Au niveau des interconnexions des pores en particulier, en raison de l’augmentation locale de la

vitesse d’une part, et de la présence des parois qui peuvent gêner le passage des cellules d’autre

part, ces déformations deviennent plus importantes, et pourraient endommager la structure de la

cellule [184]. Ce phénomène peut également être accentué en cas de bouchage partiel du pore, dû

à une accumulation locale de cellules.

Pour déterminer l’impact de ces efforts de pression sur le comportement des cellules au sein du

dispositif, nous avons donc choisi de faire varier la vitesse de perfusion−→

Vinde0à9.7×10⁻⁴m.s⁻¹.

D’après les travaux de Wendt et al. [267], ces valeurs se situent dans une zonea priorisans danger

pour les cellules. Les résultats de ces tests sont présentés sur la figure 3.10.

FIGURE3.10 – Influence de la vitesse d’écoulement du fuide sur la colonisation. A) : Répartition des cellules au sein du

dispositif (temps de pause :30min, distance perfusée :1cm, densité cellulaire : 1 million de cellules par échantillon).

B) : Taux de viabilité des cellules. Les tests sont réalisés en flux continu. Les barres d’erreur correspondent à l’écart

type des données mesurées pour les vitesses de3.17×10⁻⁴m.s⁻¹et9.7×10⁻⁴m.s⁻¹. Les tests à vitesse nulle et à

1.73×10⁻⁴m.s⁻¹ont été réalisés une fois chacun, pour comparaison.

bio-matériau) décroît quand la vitesse du fluide augmente. Le taux de viabilité, visible sur la figure

3.10.B, suit la même tendance. De plus, pour les deux vitesses les plus élevées, une fraction non

négligeable de cellules n’est pas retrouvée lors du comptage, comme c’était le cas pour les tests

réalisés à densité cellulaire élevée (voir paragraphe 3.2.1).

Même si ces tendances ne sont pas statistiquement significatives (voir l’analyse de sensibilité

présentée dans l’annexe C), elles semblent indiquer que les comportements cellulaires observés

sont plus liés à l’intensité qu’aux aspects temporels (durée, nature du chargement) des sollicitations

mécaniques auxquelles les cellules sont soumises.

Remarque : Notons tout de même que les vitesses d’écoulement imposées ici restent inférieures à

celle utilisée lors du protocole de comptage des cellules (5.77×10⁻4 m.s⁻¹). Or, aucune

augmen-tation significative de la mortalité cellulaire n’a été observée lors des tests de validation de cette

méthode de comptage (voir paragraphe 3.1.2). Ces résultats expérimentaux semblent donc

surpre-nants. Néanmoins, au début de la réalisation d’un test d’ensemencement, les cellules se situent

toutes au niveau de la face amont du biomatériau. Cette hausse de la mortalité pourrait donc être

due à un encombrement important des pores situés au niveau de cette face, engendrant des efforts

mécaniques locaux importants, dommageables pour les cellules. En tout état de cause, des tests

complémentaires devraient être réalisés par la suite pour tenter d’expliquer ce phénomène.

Rap-pelons que nous nous sommes déjà assurés à l’aide de tests additionnels que l’étape d’injection

cellulaire n’est pas à l’origine de cette hausse de mortalité (voir paragraphe 3.2.1).

Bilan

Bien que les cellules soient soumises à des sollicitations mécaniques a priori en-dessous des

seuils qui leur sont dommageables [267, 126], on observe une forte augmentation de leur taux

de mortalité au cours du protocole d’ensemencement. De plus, malgré la présence de cellules

dans la partie aval du dispositif, la fraction de cellules ensemencée reste très faible. Pour tenter de

comprendre ce qui se passe au niveau des échantillons, nous avons réalisé des coupes histologiques

après ensemencement. Leur observation, en nous renseignant sur la disposition des cellules au sein

des biomatériaux, devrait nous fournir une clé de compréhension supplémentaire concernant ce

comportement cellulaire étonnant.

Dans le document Rôle des phénomènes de transport dans la mise au point de stratégies thérapeutiques de réparation osseuse (Page 111-115)