3.1. Les populations de Culex pipiens
Les pontes F1 autogènes et anautogènes de chaque pays (Tableau VI) ont été mises à éclore dans de l’eau décolorée. Les larves ont été élevées jusqu’au stade nymphale. Les nymphes ont été récupérées et mises dans des cages en attendant l’émergence des adultes. Pour chaque population, deux types d’adultes sont obtenus: autogènes (AU) et anautogènes (AN).
Une souche de Cx. pipiens ‘Tabarka’ récoltée en Tunisie et colonisée au laboratoire pendant plusieurs générations a été utilisée pour définir au préalable certains paramètres de la compétence vectorielle.
Tableau VI.Gîtes larvaires échantillonnés en 2010 en Algérie, au Maroc et en Tunisie
Pays Ville Site Type de
gîte Autogène (AU) Ou Anautogène (AN) Echantillon Algérie
Timimoune Urbain Hypogé AU A1_AU
AN A1_AN
Chellal Urbain Hypogé AU A2_AU
AN A2_AN
Oued El Ksob Péri- urbain Epigé AU A3_AU
AN A3_AN
Bechelga Rural Epigé AU A4_AU
AN A4_AN
Maroc
Casablanca Urbain Hypogé AU M1_AU
AN M1_AN
Mohammedia Péri- urbain Hypogé AU M2_AU
AN M2_AN
Tunisie
Tabarka Urbain Epigé AU T1_AU
AN T1_AN
Nefza Rural Epigé AU T2_AU
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3.2. Les souches virales
La souche avirulente Clone 13 du VFVR, a été isolée d’un cas humain bénin en République Centre Africaine en 1974 (Muller et al., 1995). Cette souche avirulente est défective pour le facteur de virulence, la protéine NSs. En effet, le gène est délété de 70% de sa phase ouverte de lecture. La souche du VWN a été isolée d’un cheval infecté en Camargue en 2000 (Murgue et al., 2001b).
Les stocks viraux utilisés pour les infections orales des moustiques ont été produits après plusieurs passages (8 passages pour le VFVR et 4 passages pour le VWN) sur cellules Vero de rein de singe et un seul passage sur des cellules d’insectes C6/36 (Aedes albopictus). Les stocks viraux sont conservés à -80°C.
Le titre viral des stocks viraux utilisé a été estimé en unité formant plage (UFP)/mL, par comptage des plages de lyse obtenues après infection de cellules Vero (Lignée cellulaire continue de rein de singe).
3.3. Le repas sanguin infectieux
Les femelles âgées de 7 jours sont mises à jeun 24 h avant l’infection. Le repas artificiel est constitué de deux tiers de globules rouges (lavés et remis en suspension dans du tampon PBS) et un tiers de suspension virale. Le titre viral du repas infectieux est de 107,8 UFP/mL pour le VWN et de 108,5UFP/mL pour le VFVR. Un phagostimulant, l’ATP, est rajouté dans le repas à une concentration de 5.10-3
M. Les femelles se gorgent à travers une membrane d’intestin de porc soutenant le sang infecté pendant 30 min. Ainsi, les femelles pleinement gorgées sont triées, placées dans des boites en carton et nourries avec un coton imbibé d’eau sucrée à 10 % (Figure 21).
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Figure 21. Infections expérimentales des moustiques en laboratoire P3
3.4. La salivation forcée
Au terme de la période d’incubation qui a été définie à 14 jours pour le VWN, 14 et 21 jours pour le VFVR, les femelles sont immobilisées par le froid, les ailes et les pattes sont arrachées puis le proboscis est introduit dans un cône contenant 5 µL de sérum de veau fœtal (SVF; figure 22). Après 45 min, le contenu du cône est mis en suspension dans 45 µL du milieu Leibovitz L15 (Gibco, Invitrogen) à 10 % de SVF. Les salives et les femelles ayant salivé sont conservées à -80°C jusqu’à leur analyse. Le nombre de particules virales a été estimé en UFP/salive. Le taux de transmission (TT) représente le nombre de femelles ayant une salive infectée sur le nombre total de femelles testées.
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Figure 22. Femelle en cours de récupération de sa salive en utilisant la technique de salivation forcée.
3.5. Le titrage des salives
Les cellules Vero sont cultivées, dans des plaque à 6 puits, en milieu de cultureDulbecco’s Minimum Eaggle medium Glutamax (Gibco, Invitrogen) supplémenté en SVF à 10% et en antibiotiques (pénicilline 1000 UI/mL et streptomycine 1 mg/mL). Le lendemain de la confluence des cellules, le tapis cellulaire est infecté avec des dilutions de 10 en 10 de la salive dans du milieu de culture. Un volume de 250 µL est utilisé comme inoculum et adsorbé pendant 1 h à 37°C. Par la suite, on rajoute du milieu de culture à 2% SVF, 1% antibiotique- antimycotique (Gibco, Invitrogen) et 1% d’agarose. Les cellules sont incubées à 37°C et dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 4 (VWN) ou 5 jours (VFVR). Au
terme de la période d’incubation, le milieu gélifié est éliminé et les cellules sont fixées et colorées avec une solution contenant du cristal violet (0,2%), de la formaldéhyde (10%) et de l’éthanol (20%). Les plaques sont lavées à l’eau puis séchées et les plages de lyses sont comptées. Le nombre de particules virales dans chaque salive est exprimé en UFP/salive.
3.6. L’immunofluorescence indirecte sur squashs de tête
La détection du virus se fait par immunofluorescence indirecte sur squash de tête des moustiques (Kuberski & Rosen, 1977). Pour ce faire, les femelles sont décapitées à l’aide d’un scalpel sur une lame de verre à la fin de la salivation. Une
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dizaine de têtes sont ainsi placées sur la lame et écrasées à l’aide d’une seconde lame. Les lames sont séchées à l’air libre pendant 10 min puis fixées dans un bain d’acétone pur à -20°C pendant 20 min. Par la suite, les lames sont séchées et conservées à -80°C jusqu’à réalisation de la réaction d’immunofluorescence.
L’anticorps primaire est une ascite de souris anti-virus diluée au PBS 1X (l’ascite anti-VFVR est diluée au 1/200 et l’ascite anti-VWN, au 1/100) qu’on dépose sur les squashs de tête. Les lames sont incubées 30 min à 37°C en chambre humide puis rincées 3 fois avec du PBS 1X et séchées.
L’anticorps secondaire est une immunoglobuline anti-souris couplée à la fluorescéine (FITC) dilué au 1/100 et additionnée de bleu d’Evans. Le mélange est déposé sur les lames qui sont traitées de la même façon qu’auparavant. A la fin des rinçages, les préparations sont montées entre lame et lamelle avec du tampon phosphate glycériné à 10 % et à pH 8. La lecture des lames se fait sous microscope à épifluorescence. Les tissus infectés apparaissent en vert fluorescent et les tissus non infectés en rouge (Figure 23).
Le taux d’infection disséminée (TID) représente le nombre de femelles ayant des squashs de tête positifs rapportés au nombre total de femelles testées. Les femelles présentant un squash de tête positif sont capables d’assurer la dissémination virale au-delà du tube digestif.
(a) (b)
Figure 23. Tissus de tête de moustique analysé par immunofluorescence.Tissu infecté (a) et tissu non infecté (b)
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