Chapitre 1 : Introduction
1.6 Hypothèse de recherche et objectifs
Le rôle crucial que joue la voie MAP Kinase dans le développement normal ainsi que dans le cancer ne fait plus de doute aujourd’hui. Plus d’une centaine de substrats de ERK1/2 ont été identifiés et pourtant, de nombreux effecteurs de la voie continuent d’être caractérisés et impliquent les kinases de cette cascade à la régulation de nouveaux processus biologiques. Un portrait global des effecteurs directs de la voie n’a cependant pas été mis à jour depuis plus
d’une décennie, lorsque le groupe de Rony Seger a publié un compendium de plus d’une centaine de substrats de ERK1/2 (16). À l’ère des études protéomiques à grande échelle, un nombre considérable de potentielles nouvelles cibles ne sont pourtant observées que de manière qualitative et enfouies à travers la masse de données générées. L’importance de caractériser de manière robuste et individuelle les nouveaux effecteurs de la voie n’a pourtant d’égal que la capacité par des groupes indépendants de reproduire et valider ces données.
Outre les cibles déjà caractérisées, dans un effort pour identifier de manière systématique de nouveaux substrats de ERK1/2, notre groupe a effectué deux études phosphoprotéomiques à grande échelle (18). La première, publiée par notre groupe en 2013, fut effectuée dans la lignée cellulaire intestinale épithéliale de rat IEC-6, où l’inhibition pharmacologique de MEK1/2 suivant une stimulation au sérum a permis d’identifier plus de 200 protéines candidates pour phosphorylation par ERK1/2. La seconde étude, non-publiée à ce jour, utilise des fibroblastes embryonnaires murin génétiquement déficients en ERK1/2 et soumise à une courte stimulation à l’EGF comme modèle afin d’identifier de nouveaux substrats de ERK1/2.
Bien que plusieurs substrats validés s’y retrouvent, conférant une robustesse à cette étude, une grande majorité des candidats potentiels identifiés par ces études ne sont pas connus à ce jour. De surcroit, plusieurs de ces protéines occupent des fonctions physiologiques critiques à la cellule ainsi que des rôles dont la relation à la voie de signalisation MAP Kinase sont peu documentés. Parmi ces effecteurs se retrouvent notamment plusieurs candidats possédant des rôles dans le contrôle de l’épissage alternatif. La protéine CDK12, qui possède à la fois des fonctions suggérées au niveau de la transcription et de l’épissage, a ainsi été identifiée comme candidat potentiel de phosphorylation par ERK1/2. Cette protéine pique l’attention pour plusieurs raisons. D’une part, une hausse de son expression est souvent observée dans le cancer, suggérant un rôle oncogénique en supplément de ses rôles physiologiques normaux. De plus, au sein de la famille des CDK, aucun membre n’a été identifié comme cible de phosphorylation par ERK1/2 à ce jour. Le premier objectif de cette
thèse consiste ainsi en la validation de nouvelles cibles de phosphorylation par ERK1/2 impliquées dans le processus d’épissage alternatif, et sera traité de manière approfondie au chapitre deux.
Dans les cellules souches embryonnaires murines (mESC), ces kinases jouent un rôle critique dans la sortie du programme d’auto-renouvèlement et dans l’engagement vers une voie de différenciation. Bien que le réseau transcriptionnel gouvernant la pluripotence de ces cellules soit bien caractérisé, plusieurs autres processus moléculaires ayant des rôles clés dans la différenciation, tels que l’épissage alternatif, n’ont toujours pas été associés à une régulation par les voies de signalisation. Le contrôle de l’épissage par ERK1/2 est ainsi une hypothèse pouvant expliquer plusieurs évènements précoces dans la sortie de l’auto-renouvellement et dans la différenciation. Nous avons ainsi analysé le transcriptome de deux clones de mESC génétiquement déficientes en ERK1/2 et réexprimant la kinase ERK1. Nous avons identifié 60 isoformes épissés de manière différentielle de façon consistante dans les deux clones, dont certains ont un rôle clé connu dans le processus de différenciation. Le deuxième objectif de cette thèse et thème du troisième chapitre consiste en la caractérisation de ces changements d’épissages en réponse à une stimulation de la voie MAP Kinase.
Une autre protéine candidate fort intéressante issue de l’étude phosphoprotéomique publiée en 2013 est la beta-caténine (18). De multiples interactions existent entre ces voies de signalisation et l’importance de les caractériser est exacerbée par l’implication conjointe de ces deux voies dans le cancer colorectal. Des résultats préliminaires de notre laboratoire suggèrent cependant que la beta-caténine n’est pas une cible de ERK1/2 en essai de phosphorylation in vitro, contrairement à une majorité de candidats issus de ces études. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de MEK1/2 comme stratégie afin de mettre en évidence des cibles moléculaires de ERK1/2 repose sur le concept que MEK1/2 n’a que comme unique substrat les MAP Kinases ERK1/2. Considérant que l’existence de substrats alternatifs de MEK1/2 ont déjà été décrits, sans être confirmés ni infirmés, on ne peut pas exclure la possibilité que certaines de ces cibles puissent être phosphorylées par MEK1/2
plutôt que ERK1/2. En conséquence, nous avons évalué cette possibilité de manière robuste par essai kinase in vitro à l’aide de deux kinases MEK1 recombinantes actives, et observé dans les deux cas une forte phosphorylation de la beta-caténine par MEK. La caractérisation de la beta-caténine comme substrat potentiel de MEK1/2 est le dernier objectif de cette thèse, qui sera abordé au chapitre quatre.