Hydrogels de fibrinogène PEGylé

La dégradation des réseaux de protéines peut être ralentie en protégeant le squelette protéique par greffage d’un polymère tel que le PEG. Cette modification permet, en effet, d’augmenter d’un facteur 10 la demi-vie plasmatique des peptiques thérapeutiques ou des principes actifs protéiques. De la même manière, la PEGylation a largement été utilisée. Son principe appliqué au fibrinogène est illustré par la Figure 35. On parle alors de gels hybrides : leur stabilité physique est améliorée et leur sensibilité à la dégradation enzymatique est réduite, mais la synthèse de ces hydrogels n’utilise pas de composés cytotoxiques (tels que

les carbodiimides ou les N-hydroxysuccinimides 147,150) risquant d’affecter l’activité cellulaire.

Figure 35 : illustration schématique de l’assemblage des hydrogels de fibrinogène PEGylé. Les fragments de fibrinogène PEGylés (A) contiennent des sites de clivages par des protéases (jaune) et de nombreux thiols non liés pour la liaison covalente de PEG fonctionnalisé via une addition de Michael (rouge). La formation de l’hydrogel de PEG-fibrinogène (B) est accomplie par photoamorçage du PEG-DA (diacrylate) qui n’a pas réagi. Cela permet la

formation d’un réseau de fibrinogène PEGylé 167.

L’équipe de Seliktar a PEGylé du fibrinogène avec du PEG 6 ou 10 kDa, ensuite photopolymérisé en présence d’Irgacure 2959, pour former des hydrogels ayant des propriétés structurales modulables. La présence du fibrinogène assure une bonne adhérence cellulaire à l’hydrogel, tandis que le PEG permet de

contrôler sa dégradation 167. En présence de collagénase ou de trypsine, un hydrogel fibrinogène-PEG 10 kDa

n’est dégradé que de 20% en 150 min alors que les gels de fibrine sont complètement dégradés 82. Cependant,

65 pas être trop augmentée, sous peine de limiter l’adhérence cellulaire. Ces hydrogels favorisent la réparation

osseuse, sans libération de facteurs ostéogéniques 168, mais ils orientent aussi la différenciation de

mésoangioblastes vers un phénotype de myocytes, pour le soin des dystrophies musculaires 176. De plus,

l’architecture de ce réseau peut être modifiée par l’incorporation de micelles de Pluronic® F127 qui modifient

les propriétés viscoélastiques et le comportement cellulaire au sein du gel 177.

7.1.2.Hydrogels d’albumine PEGylée

Des hydrogels de BSA PEGylée ont également été synthétisés 178,179. L’albumine ne fait pas partie de

la MEC mais cette protéine sérique, circulante, est l’une des protéines les plus étudiées en biochimie. L’albumine humaine, de poids moléculaire de 66,5 kDa, est la protéine la plus présente dans le plasma sanguin. Elle contient beaucoup d’hélices (70%) et de nombreuses cystéines, la plupart formant des ponts

disulfure qui contribuent à sa structure tridimensionnelle globulaire (17) 180. Elle possède une affinité

importante pour différentes molécules, en particulier pour les acides gras. Une molécule d’albumine peut

lier jusqu’à 6 acides gras (Figure 36). Elle est également capable de transporter des principes actifs variés,

qu’elle lie (par des liaisons faibles) au niveau de deux domaines d’affinité principaux 179 mais aussi de façon

covalente par réaction avec un groupement thiol libre. L’albumine peut gélifier d’elle-même par dénaturation

liée au pH et à la température 181, ou par réduction de ses ponts disulfure 182,183. Cependant, ces gels

présentent une stabilité très limitée et des propriétés viscoélastiques faibles (G’ = 60 Pa). Des hydrogels synthétisés à partir d’albumine PEGylée ont donc été développés : leur application principale est la délivrance contrôlée de principes actifs retenus dans le gel d’albumine.

Figure 36 : structure tridimensionnelle de l’albumine humaine, ici complexée avec des acides gras (représentés en gris) 184.

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Ces gels peuvent être synthétisés avec des PEG de différentes masses comprises entre 4,6 et 20 kDa,

afin de modifier l’affinité de l’albumine pour les principes actifs retenus dans les réseaux ainsi formés 185. Le

taux de relargage peut être contrôlé par la composition de l’hydrogel 186. Ces gels étant photopolymérisables,

ils peuvent être formés in situ pour permettre la délivrance locale d’agents thérapeutiques. L’incorporation de fibrinogène PEGylé à un gel de BSA-PEG permet d’améliorer la biocompatibilité et la régénération

tissulaire 83. Cependant, ces réseaux hybrides ont un module de stockage très faible (30 Pa) et se dégradent

intégralement en moins de 7h en présence d’une solution de collagénase 81. Leur biocompatibilité est

néanmoins très bonne et ils pourraient être utilisés pour le relargage de principes actifs sur des durées prolongées. De plus, l’albumine peut être produite de façon recombinante dans la levure Pichia Pastoris, en

grande quantité et purifiée à un grade pharmaceutique 182. Cela permet de s’affranchir des problèmes de

pureté et d’immunogénicité rencontrés avec les albumines provenant d’autres sources.

7.1.3.Hydrogels de PEG contenant des segments peptidiques

D’autres approches ont été explorées, notamment par l’équipe de Hubbell, pour la synthèse d’hydrogels hybrides multifonctionnels, s’affranchissant des protéines entières. Des segments sensibles à certaines métalloprotéases sont greffés sur des macromères de PEG. La réticulation se fait par voie

radicalaire, et les hydrogels peuvent alors être dégradés par une protéase spécifique 74,75,187. Des peptides

incorporant la séquence RGD peuvent également être introduits au sein du réseau 74. Les gels ainsi obtenus

sont non seulement sensibles aux protéases, mais ils servent également de support pour l’adhérence et l’étalement cellulaires. La conjugaison de ces deux éléments est cruciale pour la colonisation par les cellules. Ces gels peuvent être utilisés pour combler d’importants défauts osseux et ils favoriseraient la formation de

tissu osseux fonctionnel 74.

Dans d’autres travaux, des molécules de PEG sont préalablement fonctionnalisées par un segment contenant un site de coupure pour une MMP ou un site RGD. Ceux-ci peuvent réagir par voie enzymatique pour former des hydrogels hybrides. La transglutaminase réticule ensuite ces deux segments protéiques

ensemble en présence de Ca2+ (Figure 37) 188,189. Des facteurs de croissance, tels que le VEGF, peuvent

également être incorporés à ce réseau, sur le même principe de réticulation catalysée par la transglutaminase

67 Figure 37 : formation d'un réseau de PEG multifonctionnel catalysée par la transglutaminase. La transglutaminase (Facteur XIIIa) est utilisée pour réticuler deux conjugués de PEG multi-bras liés à des peptides : n-PEG-MMP-Lys et n-PEG-Gln (avec ici, n=8) est combiné avec un peptide d’adhérence cellulaire TG-Gln-RGD, pour former un hydrogel

hybride multifonctionnel 188.

Lors de culture cellulaire tridimensionnelle, la présence de motifs RGD est essentielle pour

l’attachement cellulaire et leur étalement au sein du gel peut être corrélé à la concentration en RGD 188,189.

Les cellules expriment des quantités importantes de MMP2, ce qui indique qu’elles remodèlent leur

microenvironnement extracellulaire 189. Elles créent ainsi un espace suffisant pour leur prolifération. Le

relargage du VEGF lors du clivage protéolytique du gel est associé à une augmentation de l’angiogenèse 188.

Des gels de PEG contenant également des segments sensibles aux métalloprotéases et des sites RGD peuvent aussi être réticulés par une addition de Michael, pour l’encapsulation de cellules endothéliales et de

fibroblastes 190. Ce type de gel permet une bonne vascularisation, liée à la dégradation partielle du réseau

par les MMP sécrétées par les cellules. Cela permet d’envisager une application de ce matériau injectable pour le traitement des maladies ischémiques.

Suivant une stratégie similaire, l’incorporation de peptides RGD et VEGF au sein d’hydrogels de PEG maléimide (Figure 38) permet d’obtenir une matrice pour l’encapsulation de cellules pancréatiques. Ces

matériaux sont destinés au traitement du diabète de type 1 191. La dégradation du réseau permet le relargage

du VEGF, qui a pour conséquence une meilleure vascularisation et, sur le plus long terme, une bonne intégration des îlots cellulaires dans le pancréas.

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Figure 38 : le macromère de PEG-maléimide à 4 bras est fonctionnalisé par une réaction de Michael avec un peptide RGD et le facteur de croissance VEGF. Le gel est formé en présence d’un peptide portant la séquence CGCRDVPMSMRGGDRCGC. Les protéases exprimées par les cellules dégradent l’hydrogel en clivant le réticulant

peptidique, et en relarguant le VEGF 191.

Pour la régénération d’importants défauts osseux, le RGD a été remplacé par de l’hexapeptide

GFOGER dans un gel de PEG-maléimide 192. Cette séquence, retrouvée dans le collagène de type I, permet

une interaction avec l’intégrine 21, signal crucial pour la différenciation entre phénotype ostéogénique et minéralisation. Le VEGF est alors remplacé par de la BMP2. Cet hydrogel possède une activité ostéogénique intrinsèque, et permet la réparation de défauts osseux de taille critique, avec une efficacité supérieure aux mousses de collagène habituellement utilisées.

Bien que ces hydrogels avec des architectures de coréseaux (ou réseau de copolymères) présentent d’incontestables qualités, et peuvent être utilisés dans de nombreux domaines, ils présentent plusieurs inconvénients. Les réseaux de macromolécules naturelles présents in vivo, que ce soit le réseau de collagène, d’acide hyaluronique ou de fibrine, sont en effet, dénaturés puisque modifiés chimiquement. Ils sont également produits à très petite échelle, et le coût de production des peptides synthétiques et des protéines recombinantes demeure très élevé.

7.2.Réseaux Interpénétrés de Polymères (RIPs)

Une voie élégante qui permet d’associer des macromolécules de natures différentes est la synthèse de réseaux interpénétrés de polymères (RIPs). Ils sont définis selon Sperling comme la combinaison de deux,

ou plus, réseaux de polymères synthétisés l’un en présence de l’autre 193. Les réseaux sont partiellement

enchevêtrés, mais sans lien covalent entre eux 194. L'enchevêtrement de deux polymères réticulés au sein

d’un RIP conduit à une « miscibilité forcée » comparée à celle des mélanges de polymères, habituellement incompatibles. Une conséquence de la réticulation de chaque composant du RIP est que cette architecture est dimensionnellement stable dans le temps, même sous contrainte ou action de la température. Ces

69 associations de polymères sont, en général, réalisées dans le but d’élaborer de nouveaux matériaux associant les propriétés recherchées de chacun des partenaires tout en minimisant leurs défauts.

Les RIPs peuvent être préparés par deux méthodes : la synthèse simultanée consiste à mélanger les précurseurs des deux réseaux dans une solution homogène et les deux réseaux sont formés, simultanément ou l’un après l’autre, par des mécanismes de polymérisation/réticulation différents et indépendants (Figure 39A). La synthèse séquentielle est réalisée en deux étapes : un premier réseau est synthétisé puis il est gonflé par une solution contenant les précurseurs du second réseau (Figure 39B). La synthèse du second réseau est ensuite déclenchée au sein du premier réseau.

Figure 39 : représentation schématique de la synthèse (A) simultanée ; (B) séquentielle des RIPs 195.

Lorsque l’un des polymères est linéaire mais emprisonné dans le réseau de l’autre polymère, l’architecture est alors qualifiée de réseau semi-interpénétré de polymères (semi-RIP). Il est parfois possible

de réaliser ensuite la réticulation sélective de ce polymère linéaire pour obtenir un RIP 195.

Des matériaux présentant une architecture de réseaux interpénétrés de polymères ont été proposés comme alternative avantageuse, en utilisant une ou plusieurs macromolécules naturelles intactes pour former des hydrogels. Le coût de fabrication des hydrogels est alors bien inférieur et la structure native de la protéine est préservée. Des taux de dégradation plus élevés ainsi qu’une meilleure bioactivité sont obtenus. Un nombre important d’hydrogels constitués, soit d’une combinaison de polymères synthétiques, soit d’un réseau de polymère synthétique associé à un réseau de macromolécules d’origine biologique, ou encore de deux réseaux de macromolécules biologiques, ont été décrits. Cependant, nous ne présenterons ici que les hydrogels contenant au moins un partenaire d’origine biologique provenant des mammifères. En

M1 C1 M2 C1

Polymérisation par deux voies non intérférentes

M1 C1 M2 C1 Gonflement dans Puis polymérisation (A) (B)