Etude de la diffusion des sels d’ammonium

L’effet inhibiteur sur la croissance bactérienne a été vérifié en conditions planctoniques pour les deux sels d’ammonium testés (cf.§ 2.2) mais, nous avons préalablement vérifié la diffusion du benzyl ammonium hors des matériaux dans lesquels il est encapsulé.

5.1.1.Diffusion vers un milieu liquide

Afin de vérifier la diffusion ou non des sels d’ammonium hors des matériaux, ces derniers ont été incubés pendant 72h dans un volume 10 fois supérieur de tampon Tris, à 37°C. La solution d’extraction a ensuite été dosée à partir de son absorbance à 210 nm. Connaissant la quantité de sel d’ammonium introduite dans le matériau et son coefficient d’extinction molaire (cf § 2.1), la quantité extraite a été exprimée en pourcentage de la quantité initialement introduite.

Moins de 1% de styrène ammonium peut être extrait des RIPs qui en contiennent. Ce résultat confirme la copolymérisation quasi-quantitative du Styrène Ammonium au sein de l’hydrogel. Par contre, de façon surprenante, alors que l’on attend une valeur proche de 100%, la proportion de Benzyl Ammonium relargué hors des RIPs POE-BSA/Fb est inférieure à 5%, quelle que soit la formulation. Ces proportions restent très faibles que la diffusion soit faite contre du tampon Tris 50 mM ou contre de l’eau déionisée. Le Benzyl

Ammonium étant un composé de masse faible (186 g.mol-1), sa diffusion ne doit pas être limitée par sa taille.

Il est plausible que des interactions de faible énergie le retiennent dans le matériau. En effet, les ammoniums peuvent interagir, via leur charge positive, avec les acides aminés chargés négativement (acide glutamique et acide aspartique). Cela expliquerait, qu’à pH neutre, il n’est pas possible d’extraire le Benzyl Ammonium du RIP. Pour vérifier cette hypothèse, la diffusion a donc été réalisée contre un tampon Glycine 50 mM à pH 2, pendant 3 jours à 37°C (Figure 104).

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Figure 104 : pourcentage de Benzyl Ammonium relargué des RIPs POE-BSA-BN/Fb contre du tampon à pH 2. Le test statistique est effectué par rapport à l’extraction contre du Tris à pH 7,4. * < 0,05 ; ** < 0,01 ; *** < 0,001.

La quantité de Benzyl Ammonium extraite avec un tampon à pH2 est significativement (test de Student) plus élevée que lorsque l’extraction est réalisée avec un tampon à pH neutre. Pour la série de RIPs

POE(2)BSA(8)BN+(z)/Fb, plus la quantité de Benzyl Ammonium dans le matériau est élevée, plus l’extraction

est importante (environ 7 à 20% lorsque le RIP contient respectivement 1 et 5% de BN+). Pour le RIP

POE(5)BSA(5)BN+(z)/Fb, les valeurs sont de l’ordre de 10 à 15%, quelle que soit la quantité de Benzyl

Ammonium introduite. L’architecture RIP contenant seulement 2% de POE semble donc mieux se prêter à la diffusion du Benzyl Ammonium que celle d’un RIP en contenant 5%.

Ainsi, même dans ces conditions de pH acide, moins de 20% du Benzyl Ammonium sont extraits après 3 jours, ce qui est faible.

5.1.2.Diffusion vers un milieu gélosé

Nous avons ensuite étudié l’impact de la diffusion du Benzyl Ammonium sur des bactéries ensemencées sur un milieu solide. Pour cela, une boîte de Pétri est ensemencée avec une suspension

bactérienne calibrée à 106 UFC.mL-1 et un matériau est placé en son centre. Après une nuit d’incubation à

37°C, l’impact de la présence du matériau est photographiée (Figure 105). *** ** * *** *** *** 0 5 10 15 20 25 30 Sty rè n e Amm o n iu m re largu é [% ] pH 7,4 pH 2

161 Figure 105 : photographie de géloses recouvertes de colonies de E.coli (A) et (C) ou S.epidermidis (B) et (D), après 18h d’incubation à 37°C des RIPs POE(2)BSA(8)SN+(5)/Fb (A) et (B) ou POE(2)BSA(8)BN+(5)/Fb (C) et (D) en surface.

Que les RIP POE-BSA/FB contiennent du Styrène Ammonium ou du Benzyl Ammonium, aucun cercle d’inhibition n’est observé autour des matériaux. Cela n’est pas surprenant puisque, d’une part, le Styrène Ammonium est réticulé et que, d’autre part, le Benzyl Ammonium diffuse peu hors des matériaux (cf.§ 5.1.1) et cette quantité doit être trop faible pour avoir un effet notable sur les colonies.

Dans tous les cas, lorsque le matériau est soulevé, aucune colonie n’est observée en dessous. Cela peut être lié, soit à une inhibition de contact due à la présence des sels d’ammonium dans le matériau, soit à des conditions de croissance sous-optimales qui retardent l’apparition des colonies. L'hypothèse d'une inhibition de contact est confirmée par la présence de quelques colonies sous les RIPs qui ne contiennent pas de sels d'ammonium.

Afin de compléter ces premières mesures, nous avons modifié le protocole d’incorporation des sels d’ammonium dans les RIPs. Ainsi, des RIPs POE(2)BSA(8)/Fb et POE(5)BSA(5)/Fb sont synthétisés, puis placés dans un volume 10 fois plus important de solution de Styrène Ammonium à une concentration de 10, 30 ou

50 mg.mL-1 sous agitation et à 37°C pendant 24h. Le lendemain, ces matériaux gonflés sont déposés au centre

des géloses ensemencées. Quelques photographies représentatives des résultats obtenus sont présentées sur la Figure 106 et sont comparées à celles qui sont obtenues avec un RIP POE(2)BSA(8)/Fb gonflé de PHMB (lequel est un puissant bactéricide).

Figure 106 : photographies de géloses recouvertes de colonies de S.epidermidis ou E.coli, après 18h d’incubation à 37°C des RIPs POE(2)BSA(8)/Fb gonflés avec (A) du PHMB à 0,2%, (B) du SN+ 1% et (C) du SN+ 5%.

(A) (B) (C) (D)

162 % S.epidermidis E.coli PHMB 0,2 ++++ ++++ POE(2)BSA(8)/Fb gonflé SN+(z) SN+(1) + ++ SN+(3) ++ ++ SN+(5) ++ +++ POE(5)BSA(5) Fb gonflé SN+(z) SN+(1) - + SN+(3) + +++ SN+(5) ++ +++

Tableau 11 : taille approximative du cercle d’inhibition observé autour des matériaux gonflés dans différentes solutions de Styrène Ammonium et de PHMB (contrôle positif).

Lorsque le Styrène Ammonium est incorporé au matériau post-synthèse, par gonflement, il semble être relargué, au moins en partie, puisqu’on observe un cercle d’inhibition dans lequel les bactéries sont incapables de pousser. Le Styrène Ammonium peut donc pénétrer dans le matériau depuis l’extérieur. Cependant, nous ne disposons d’aucune information supplémentaire permettant de savoir à quel point cette molécule diffuse (jusqu’au cœur du matériau, ou simplement en surface).

Ainsi, il est possible de faire gonfler les matériaux avec des sels d’ammonium pour les rendre bactéricides.