Fractionnement par EPC en mode gradient

Au vu des résultats obtenus lors de l’essai du dual mode pour fractionner l’extrait PGPAF, un autre fractionnement a été envisagé reposant sur l’utilisation d’un gradient de phase mobile afin d’essayer d’améliorer la séparation des vismiones ayant tendance à coéluer.

L’élution en mode gradient consiste à modifier la composition de la phase mobile au cours du processus de fractionnement. Ce mode est particulièrement utile lorsque les constituants du mélange à séparer présentent des valeurs de KD très différentes les unes des autres.

Une séparation en mode ascendant avec un gradient allant du système Hept/EtOAc/MeOH/H2O 8:1:8:1 (v/v/v/v) au système Hept/EtOAc/MeOH/H2O 4:1:4:1 (v/v/v/v) a été effectuée. La phase stationnaire utilisée correspond à la phase inférieure du système intermédiaire Hept/EtOAc/MeOH/H2O 6:1:6:1 (v/v/v/v).

Le détail des conditions expérimentales est précisé au paragraphe 6.5.2 (p 237).

200 tubes de 10 mL ont été collectés et regroupés selon leur profil CCM en 14 fractions dont le profil CCM est présenté dans la Figure 91.

Figure 91 : Fractionnement EPC de la fraction enrichie PGPAF en en mode gradient.

Conditions CCM : Eluant Hept/AcOEt (50:50), révélation VS.

0,25 0,5 0,75

Début du gradient Fin du gradient Extrusion

On observe que les vismiones présentant un faible KD, très affines pour la phase stationnaire lors du fractionnement précédent réalisé en dual mode, ont toujours tendance à être retenues de manière importante par la phase stationnaire (Fractions 11 à 14). Elles ne sortent en effet de la colonne qu’au moment de l’extrusion. On observe également que les vismiones présentant un KD très proche (vismione D (33) et acétylvismione F (44), fraction 5) ont toujours tendance à coéluer.

L’utilisation du mode gradient ne présente donc pas d’intérêt particulier pour le fractionnement de la fraction PGPAF.

5.7.3 Discussion

Différentes conditions et modes de fractionnement ont été envisagées afin de séparer les vismiones contenues dans la fraction enrichie en vismiones polaires PGPAF. L’objectif était de développer une méthode permettant de séparer ces molécules en une seule étape d’extraction de partage centrifuge.

Cette fraction présente néanmoins l’inconvénient de contenir des molécules de polarités très différentes et donc une plage de coefficients de partage très importante. D’autre part, certaines des molécules contenues dans la fraction présentent des coefficients de partage très proches les uns des autres ce qui entraîne une faible sélectivité et provoque des phénomènes de co-élution.

L’utilisation d’un mode tel que le pH-zone refining qui consiste à créer un gradient de pH au sein de la colonne permettant ainsi d’éluer les constituants d’un extrait d’une part selon les coefficients de partage mais également selon leur pKa, pourrait permettre de résoudre cette problématique de coélution. Ce mode consiste par exemple à utiliser une phase stationnaire basique qui se retrouve progressivement neutralisée par une phase mobile acide. Les molécules sont ainsi éluées selon deux de leurs caractéristiques permettant de résoudre des problèmes de co-élution pour des molécules présentant des coefficients de partage très proches²⁶⁶. Cependant, compte-tenu de la sensibilité des vismiones aux conditions de pH, cette technique ne s’avère pas applicable à la purification de ce type de molécules.

Néanmoins, les deux modes de fractionnement utilisés ont permis de fournir des fractions très enrichies en vismiones pouvant être purifiées en une seule étape d’HPLC semi-préparative ultérieure. La capacité de charge de l’EPC permettant aisément de séparer jusqu’à 2 g d’échantillon en un seul

run a permis un gain non négligeable de temps et de solvants en comparaison avec le fractionnement

5.8 Conclusion

Les méthodes de fractionnement conventionnelles décrites dans la littérature ayant permis l’isolement et la description des différentes vismiones connues ont, dans un premier temps, été appliquées au fractionnement de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de P. glaberrimum. Ce premier fractionnement a permis d’isoler la vismione H (94) pour la première fois dans l’espèce, ainsi que l’acétylvismione D (8), la madagascine (5) et la 3-géranyloxyémodine (12).

Cela nous a permis de nous rendre compte de la propension à la dégradation des vismiones lors des étapes de purification successives, conduisant à la formation de différents artéfacts que sont les anthrones et les anthraquinones.

Pour surmonter ces problèmes de dégradation, la chromatographie de partage centrifuge a semblé être une méthode de choix particulièrement adaptée à la purification de ce type de molécules. L’étude des systèmes de solvants nécessaires à ce type d’approche a permis de mettre en évidence l’intérêt du système ARIZONA Y (Hept/AcOEt/MeOH/H2O 19:1:19:1 v/v/v/v) pour séparer l’extrait en deux parties par une étape de fractionnement liquide-liquide : d’une part, une fraction riche en vismiones particulièrement apolaires et présentes en grande quantité dans l’extrait [Vismione H (94) et acétylvismione D (8)] et d’autre part, une fraction riche en vismiones plus polaires minoritaires dans l’extrait.

La fraction enrichie en vismiones polaires minoritaires a par la suite été fractionnée par chromatographies flash et HPLC semi-préparative répétées en polarité de phase inverse afin d’isoler les vismiones C (78), D (33), E (79), F (66), H (94) et M (42), la désacétylvismione H (97) et les acétylvismiones D (8) et F (44) avec des masses comprises entre 8 et 125 mg soit des rendements satisfaisants allant de 0,05 % à 0,9 % à partir de l’extrait brut d’écorces de P. glaberrimum PGE2E. C’est, à notre connaissance, la première fois que la désacétylvismione H (97), la vismione H (94) et la vismione M (42) sont isolées de l’espèce P. glaberrimum. C’est également la première fois qu’un aussi grand nombre de vismiones sont isolées à partir d’un seul et même extrait, soulignant l’intérêt de la méthodologie développée ici.

Cette fraction enrichie a également été purifiée par Extraction de Partage Centrifuge. Cependant, la large gamme de coefficients de partage des différentes molécules et le manque de sélectivité entre structures très proches n’a pas permis d’isoler directement les molécules. Une étape supplémentaire de purification par HPLC semi-préparative s’est en effet avérée nécessaire. La capacité de charge intéressante et les principes de séparation différents de la chromatographie en polarité de phase inverse font néanmoins de l’Extraction de Partage Centrifuge une méthode intéressante pour pré-purifier et enrichir les fractions à partir d’un mélange complexe. Cette méthodologie de fractionnement a ainsi notamment permis d’isoler une nouvelle dihydroanthracénone très minoritaire dans l’extrait, la 6-acétylatrochrysone (201) dont la structure suggère de nouvelles hypothèses quant à la biosynthèse des vismiones.

La fraction apolaire riche en vismione H (94) et acétylvismione D (8) a également été fractionnée par Extraction de Partage Centrifuge. Cette méthode permet en moins d’une heure de fractionner 3 g de fraction enrichie. Une simple étape consécutive de chromatographie flash en phase inverse permet

d’obtenir les deux vismiones pures à plus de 98% (RMN ¹H) avec un taux de recouvrement de 78% pour l’acétylvismione D (8) et 80% pour la vismione H (94) à partir de l’extrait brut dichlorométhanique d’écorce de P. glaberrimum PGE2E, en seulement 3 étapes de fractionnement. La vismione H s’étant montrée la molécule la plus intéressante sur le plan des activités biologiques, la méthodologie de fractionnement ainsi développée, permettant de purifier cette molécule sensible avec une productivité importante, est compatible avec les besoins d’une étude pharmacologique plus poussée.

6 Etude de la répartition des vismiones dans différentes espèces du