Fractionnement de la fraction PGPO par EPC

La fraction PGPO enrichie en acétylvismione D et en vismione H obtenue précédemment (paragraphe 5.2, p 100) a été fractionnée par Extraction de Partage Centrifuge selon les conditions décrites au paragraphe 6.4.1 (p 235).

Ces conditions ont permis une bonne séparation des deux vismiones d’intérêt donnant lieu à deux fractions d’intérêt très largement enrichies respectivement en acétylvismione D (F2, 1152 mg, 36 % / PGPO) et en vismione H (F3, 735 mg, 23 % / PGPO). Deux autres vismiones également présentes dans la fraction PGPO, la vismione D et l’acétylvismione F, ont été récupérées dans la fraction F4 lors de la phase d’extrusion (Figure 85). La phase d’extrusion consiste à évacuer la phase stationnaire avec de la phase mobile par effet piston en basculant du mode ascendant vers le mode descendant. Leur forte rétention par la phase stationnaire ne permet pas dans ces conditions leur séparation correcte.

Figure 85 : Fractionnement de la fraction PGPO par EPC.

Conditions CCM : Eluant Hept/AcOEt (50:50), révélation VS.

Les fractions F2 et F3, respectivement largement enrichies en acétylvismione D (8) et vismione H (94) ont ensuite été fractionnées par chromatographie flash en polarité de phase inverse sur colonne C18 permettant ainsi d’obtenir 852 mg d’acétylvismione D (8) et 453 mg de vismione H (94) avec plus de 98% de pureté estimée en RMN ¹H.

Le pourcentage de recouvrement sur l’extrait brut de départ suite à ces 3 étapes de fractionnement est estimé respectivement à 78 et 80 % pour l’acétylvismione D (8) et la vismione H (94), d’après le dosage de ces molécules réalisé dans l’extrait PGE2E (Paragraphe 6.2, p 124).

21 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 102 108 110 112 114 116 F2 Acétylvismione D F3 Vismione H 0,25 0,5 0,75 F1 F4 Extrusion

5.7.1.1 Tentative d’augmentation de la productivité du fractionnement de la fraction PGPO

L’objectif du fractionnement de la fraction PGPO est de produire de l’acétylvismione D (8) et de la vismione H (94) en quantités importantes en vue de la réalisation de tests pharmacologiques plus approfondis et de servir de matières premières à des réactions d’hémisynthèse.

5.7.1.1.1 Augmentation de la charge

Afin de purifier davantage d’extrait en une fois, la masse d’extrait injecté a été augmentée à 5 g dans les mêmes conditions de fractionnement que celles utilisées précédemment.

Cependant, une telle augmentation de la charge a conduit à un déséquilibre qui a dramatiquement réduit la rétention de la phase stationnaire à seulement 25 % provoquant une séparation médiocre et le recouvrement de certaines fractions contenant de l’acétylvismione D (8) et de la vismione H (94).

Un essai avec 4 g d’extrait n’a pas pu être réalisé du fait de la durée limitée des séjours réalisés à l’Institut de Chimie Moléculaire de Reims.

5.7.1.1.2 Utilisation du mode co-courant

Le co-courant est une technique qui peut être utilisée en cas de faible rétention de la phase stationnaire. Elle consiste à renouveler une partie de la perte de phase stationnaire en utilisant une phase mobile contenant un faible pourcentage de la phase correspondant à la phase stationnaire. Un essai en co-courant a été réalisé avec 10% de phase stationnaire dans la phase mobile en injectant 5 g de la fraction PGPO.

Avec cette technique, le volume de rétention finale a pu être restauré à 49 %, relativement proche des 59 % dans le cas de l’injection de 3 g en élution classique.

Cependant, le co-courant a l’inconvénient de ralentir l’élution des molécules possédant les KD les plus importants et d’augmenter celui présentant des KD plus faibles²⁶³.

Dans le cas de la fraction PGPO, cette technique a dramatiquement fait chuter la résolution de la séparation.

5.7.1.1.3 Multiple Dual Mode

En chromatographie de partage centrifuge, le dual mode consiste à changer le rôle de chacune des de phase liquides au cours de l’élution. La phase employée comme phase stationnaire en début d’élution devient dans un second temps la phase mobile et inversement. Ce mode d’élution permet ainsi d’éluer des composés présentant une forte affinité pour la phase stationnaire utilisée au début du fractionnement.

Le multiple dual mode dérive de ce mode d’élution. Il consiste à réaliser plusieurs étapes de dual mode successives. Entre ces différentes étapes de dual mode, l’échantillon peut être réinjecté afin d’augmenter la productivité de la purification sans avoir à vidanger et reconditionner la colonne entre les différentes injections. Ce mode est particulièrement utile pour purifier un mélange de deux analytes mal résolus et pour lesquels on observe une zone de recouvrement²⁶⁴.

Ce mode d’élution a été réalisé pour tenter d’améliorer la productivité du fractionnement de la fraction enrichie PGPO (Figure 86).

Les conditions du fractionnement sont détaillées au paragraphe 6.4.3 (p 236).

Figure 86 : Fractionnement de PGPO en Multiple Dual Mode.

Conditions CCM : Eluant Hept/AcOEt (50:50), révélation VS.

En observant la CCM des fractions recueillies, on remarque une zone de chevauchement qui apparait après la troisième injection. On observe un recouvrement de la vismione H (Rf = 0,67) et de l’acétylvismione D (Rf = 0,69) avec la madagascine (Rf = 0,84) et la 3-géranyloxyémodine (Rf = 0,88) (encadré en pointillés). L’extrait étant complexe et le volume d’injection important (18 mL pour une colonne de 300 mL), on observe un décalage des groupes de molécules ce qui provoque des coélutions. Pour éviter de tels désagréments, il aurait probablement fallu n’injecter un nouvel échantillon que tous les deux cycles afin de mieux synchroniser l’avancée des molécules dans la colonne, mais dans ce cas la productivité recherchée au départ aurait été perdue.

Ascendant Descendant Ascendant Descendant Ascendant Descendant

0,25 0,5 0,75 PGPO 2,1 g PGPO 1,1 g PGPO 1,0 g

AVD VD +AVF AVD VD + AVF AVD + VH

+ MDG + GE

VD+ AVF

5.7.1.2 Conclusion

La méthode la plus simple d’élution est aussi la plus efficace pour purifier l’acétylvismione D (8) et la vismione H (94) en Extraction de Partage Centrifuge.

Cette méthode permet ainsi en 52 minutes de fractionner 3 g de la fraction enrichie afin d’obtenir deux fractions très enrichies en chacune de ces deux molécules. Cela représente une consommation en solvant réduite d’environ 1,2 L d’heptane et 500 mL de méthanol de qualité technique nécessaires à l’élution.

Ces 2 fractions peuvent alors être purifiées en polarité de phase inverse afin d’obtenir des molécules pures à plus 98 % par estimation en RMN ¹H avec un taux de recouvrement de 78 % pour l’acétylvismione D et 80% pour la vismione H à partir de l’extrait brut dichlorométhanique d’écorce de P. glaberrimum PGE2E en seulement 3 étapes de fractionnement.