Fractionnement de l’huile essentielle brute

Une masse de 1,055 g d’huile essentielle de feuilles de Myrtus nivellei a été fractionnée sur colonne ouverte de silice (63-200 µm, 20,5 g) en utilisant un gradient pentane/oxyde de diéthyle de polarité croissante (100/0, 98/2, 0/100) (Figure III.6 p.147). Nous avons ainsi isolé 2 fractions hydrocarbonées (F1, 159 mg et F2, 61 mg) et 2 fractions oxygénées (F3, 98/2, 501 mg et F4, 0/100, 334 mg) qui ont été analysées par CPG(Ir), CPG-SM et RMN ¹³C.

L’analyse des fractions hydrocarbonées F1 et F2 a permis d’identifier le (Z)-β-ocimène (F2, 0,4% ; HE, 0,1 %) et de confirmer l’identification des monoterpènes et d’un sesquiterpène hydrocarbonés, identifiés préalablement par CPG-SM mais présents à des teneurs inférieures à 0,4 % dans l’huile essentielle globale (Tableau III.1 p.152).

En ce qui concerne la fraction F3, éluée avec un gradient pentane/oxyde de diéthyle 98/2, son analyse a simplement permis la confirmation des différents monoterpènes oxygénés déjà identifiés dans l’huile essentielle (Tableau III.1 p.152).

Enfin, la fraction F4 est celle qui a le plus attiré notre attention. En effet, éluée à l’oxyde de diéthyle, elle est celle dans laquelle nous sommes parvenus à concentrer les composés A (Ir^a/Ir^p = 1582/2179 ; 26,8 %) et B (Ir^a/Ir^p = 1594/2270 ; 6,5 %) que nous cherchions à identifier. Nous y avons également identifié le géraniol (F4, 1,5 % ; HE, 0,1 %). Néanmoins, afin de concentrer davantage A et B pour mener à bien une analyse structurale par RMN bidimensionnelle, nous avons de nouveau procédé à un fractionnement d’une partie de F4 (250 mg) sur colonne ouverte de silice (63-200 µm) avec un gradient pentane/oxyde de diéthyle de polarité croissante (96/4-0/100) (Figure III.6 p.147). Vingt-huit fractions (F4.1-F4.28) ont ainsi été éluées et analysées par CPG(Ir) et RMN 13C. Le composé B a été concentré dans la fraction F4-23 (P/E : 90/10, 5 mg) à 77 % et le composé A était présent dans les fractions F4-10 à F4-12 (P/E : 95/5, 19-20 mg chacune). Aussi, ces trois fractions

(F4-10, F4-11 et F4-12) ont été réunies et de nouveau fractionnées sur une colonne ouverte de silice d’une granulométrie plus fine (35-70 µm) (Figure III.6 p.147). Dix-huit fractions (f1-f16) ont été éluées parmi lesquelles f16 (P/E : 95/5, 11mg) contenant A à 84 %.

Ainsi, afin d’identifier les composés A et B, nous avons mené une étude par RMN bidimensionnelle sur les fractions f16 (A, 84 %) et F4.23 (B, 77 %), que nous détaillons dans la suite de ce paragraphe. La présence de composés minoritaires au sein de ces fractions n’a pas été un obstacle à l’élucidation structurale.

Figure III.6 : Schéma de fractionnement de l’huile essentielle de M. nivellei (TAS2).

Huile essentielle de M. nivellei (1,055 g)

Chromatographie sur colonne SiO₂ (63-200 µm)

Gradient Pentane / Et₂O F1 159 mg 98/2 100/0 F2 61 mg F3 501 mg F4-1 - F4-4 22 mg 96/4 A (1582/2179) 26,8 % B (1594/2270) 6,5 % 250 mg de F4 CC SiO₂ (63-200 µm) Gradient Pentane / Et₂O 100/0 0/100 F4 334 mg F4-5 - F4-9 43 mg F4-15 - F4-24 57 mg F4-25 - F4-28 30 mg 95/5 90/10 0/100 B (1594/2270) 77,0 % CC SiO₂ (35-70 µm) Pentane / Et₂O : 95/5 F4-10 - F4-12 60 mg contenant A F4-13 - F4-14 27 mg f1 - f18 dont f16 (11mg) contenant

• Identification des composés A et B par RMN bidimensionnelle.

* Composé A

L’analyse de la sous fraction f16 par CPG(Ir) montre la présence du composé A majoritaire à 84 % et ayant pour couple d’indices de rétention Ir^a/Ir^p = 1582/2179. Le spectre de RMN ¹³C de cette fraction laisse apparaître 15 raies de résonance de forte intensité appartenant au composé recherché. La séquence DEPT nous a permis de distinguer :

v) 5 atomes de carbone quaternaires dont 1 éthylénique (δ = 131,34 ppm) ; vi) 3 méthines dont 1 éthylénique (δ = 130,07 ppm) ;

vii) 1 méthylène aliphatique (δ = 39,33 ppm) et

viii) 6 méthyles (δ = 18,59 ; 20,94 ; 24,03 ; 24,45 ; 26,72 et 27,17 ppm).

Nous notons également la présence d’une fonction cétone (δ = 215,46 ppm) et d’une fonction ester (δ = 170,73 ppm). Plus précisément, les valeurs de déplacements chimiques déblindées à 81,15 et 77,26 ppm confirment l’existence d’un groupement acétate (méthyle avec δC=20,94 ppm et δH=2,17 ppm) et suggèrent la présence d’une autre fonction oxygénée, à savoir un alcool. Ces informations nous permettent d’avancer la formule brute C15H24O4, confirmée par l’analyse CPG-SM-TOF qui donne pour A une masse exacte m/z=268,1684 (valeur calculée : 268,1668). Nous en déduisons ainsi la présence de 4 centres d’insaturation parmi lesquels une fonction cétone, une fonction ester, une double liaison trisubstituée, la quatrième insaturation correspondant à un cycle. D’autre part, le motif 3-méthylbutoxy [-CO-CH2-CH(CH3)2], courant dans les composés naturels, est mis en évidence par la présence de signaux caractéristiques sur les spectres de RMN ¹³C et RMN ¹H, et confirmé par les corrélations ¹H-¹³C observées sur le spectre HMBC (Tableau III.2,

Figure III.7). Il reste ainsi 3 groupements méthyle et par déduction, un motif cyclopentène

substitué. La mise en œuvre des séquences de RMN 2D (COSY, HMBC) nous indique que l’ensemble des groupements fonctionnels (acétate, 3-méthylbutoxy, alcool) ainsi que les trois méthyles sont rattachés au cyclopentène (Tableau III.2, Figure III.7). Le composé A a ainsi été identifié comme étant le 1-hydroxy-1-(3-méthylbutoxy)-2-acétoxy-3,5,5-triméthyl-3-cyclopentène. En revanche, ni les valeurs des déplacements chimiques des ¹H et ¹³C, ni les corrélations spatiales ¹H-¹³C du spectre NOESY (aucune information supplémentaire apportée) ne nous ont permis de déterminer la stéréochimie des groupements oxygénés présents dans le composé A.

Figure III.7 : Structure du composé A et principales corrélations ¹H-¹³C observées sur le spectre HMBC.

Tableau III.2 : Données RMN 1H et 13C relatives au composé A.

C _δ(13C) DEPT δ(¹H) Proton Multiplicité (J, Hz) COSY ¹H-¹H HMBC (H→C)

C1 81,15 C C2 77,26 CH 5,62 m 4, 6 1, 3, 4, 9, 12 C3 131,34 C C4 130,07 CH 5,36 m 2, 6 2, 5, 6, 7, 11 C5 44,32 C C6 18,59 CH3 1,68 t (1,3) 2, 4 2, 3, 4, 8 C7 27,17 CH3 1,26 s 4, 5, 8, 11 C8 26,72 CH3 1,24 s 1, 4, 5, 7, 11 C9 170,43 C C10 20,94 CH3 2,17 s 2, 9 C11 215,46 C C12 39,33 CH2 1,87 a dd (14,7 ; 8,6) 12b, 13 1, 2, 11, 13, 14 1,78 b dd (14,7 ; 4,0) 12a, 13 1, 2, 11, 13, 14 C13 24,26 CH 1,50 m 12, 14, 15 C14 24,03 CH₃ 0,97 d (6,7) 13 12, 13 C15 24,45 CH3 0,83 d (6,7) 13 12, 13

* Composé B

L’analyse de la sous fraction F4-23 par CPG(Ir) montre la présence du composé B majoritaire à 77 % et ayant pour couple d’indices de rétention Ira/Irp = 1594/2270. Le spectre de RMN ¹³C de cette fraction laisse apparaître 15 raies de résonance de forte intensité appartenant au composé recherché. La séquence DEPT nous a permis de distinguer :

i) 6 atomes de carbone quaternaires dont 2 éthyléniques (δ = 130,87 et 141,98 ppm) ; ii) 3 méthines dont 2 éthyléniques (δ = 120,41 et 130,54 ppm) et

iii) 6 méthyles (δ = 18,56 ; 18,64 ; 20,99 ; 25,99 ; 26,89 et 27,92 ppm).

L’observation des valeurs des déplacements chimiques sur les spectres 1H et 13C, ainsi que la masse exacte m/z=266,1552 mesurée par CPG-SM-TOF (valeur calculée : 266,1512), nous ont permis de déduire la formule brute du composé B comme étant C15H22O4. Ces informations nous permettent de dire dans un premier temps que la formule du composé B ne diffère de celle du composé A que par la perte de deux atomes d’hydrogène. D’autre part, l’examen des spectres ¹H et ¹³C montre une similarité de la plupart des valeurs du composé B avec celle du composé A et met en évidence la présence d’une double liaison supplémentaire (δ=120,41 et 141,98 ppm). Le groupement acétate (valeurs δ=170,73 et 77,90 ppm avec un méthyle δC=20,94 ppm et δH=2,17 ppm), la fonction alcool (79,48 ppm) et les trois groupements méthyle (δ = 18,64 ; 25,99 et 27,92 ppm) sont présents. Seul le motif 3-méthylbutoxy observé dans le composé A n’est pas retrouvé dans le composé B. En revanche, les valeurs des déplacements chimiques en RMN ¹H et RMN ¹³C, associées aux corrélations observées sur le spectre HMBC, mettent en évidence la présence d’un motif isopentényloxy. En effet, nous observons :

- d’une part, la présence d’un motif isopentényl (δ=120,41 et 141,98 ppm pour la double liaison, δ=18,56 et 26,89 pour les méthyles et corrélation des protons H14 et H15 avec H12) ;

- d’autre part, une fonction carbonyle avec une valeur de déplacement chimique de 211,80 ppm, plus blindée que dans le composé A ;

- enfin, les corrélations du proton H12 avec les carbones C11, C14 et C15 nous permettent de déduire le motif isopentényloxy, et sa corrélation avec C1 nous indique que ce motif est directement relié au cyclopentène.

Plus largement, l’ensemble des corrélations observées sur le spectre HMBC (Tableau