La fluorescence est un phénomène physico-chimique relié aux changements d’états des électrons de valence d’une molécule. Un électron peut acquérir l’énergie suffisante pour passer d’un niveau fondamental (S0) à un niveau excité (S1, S2 etc.) après avoir absorber l’énergie d’un photon (hνA) d’énergie égale à la différence d’énergie entre ces deux niveaux d’énergie (voir Figure 2.5). Dans l’état excité, l’électron pourra subir une conversion interne et perdre de l’énergie par vibration et ensuite revenir au niveau fondamental, en perdant de l’énergie par radiation électromagnétique, c’est-à-dire par l’émission d’un photon d’énergie hνF. C’est ce que l’on appelle la fluorescence. Le photon émis aura par conséquent une énergie plus faible que le photon d’excitation. Ce phénomène s’appelle le déplacement de Stokes («Stokes’ shift»). Le phénomène de phosphorescence
diffère légèrement de la fluorescence puisque sous l’état excité S1 ou S2, les électrons peuvent, dans certaines conditions particulières, subir un croisement intersystème où ils sont délocalisés vers un état excité de type triplet (T1). L’électron passe davantage de temps dans ce type d’état excité parce que la transition entre un état triplet et un singulet est en fait interdite. Ceci fait que le temps de vie de l’état excité est de l’ordre de la minute et de
l’heure pour la phosphorescence alors qu’il est de l’ordre de la nanoseconde pour la fluorescence.
Figure 2.5 : Diagramme de Jablonski.
Les sondes fluorescentes sont extrêmement sensibles à leur environement immédiat. Le solvant peut par exemple influencer la position spectrale de la lumière émise par certaines sondes fluorescentes par diverses interactions solvant-fluorophore qui peuvent être complexes. En général, l’interaction entre les dipôles du solvant et de la sonde fluorescente augmente l’énergie de l’état fondamental et diminue celle de l’état excité de la sonde, ce qui engendre une diminution de l’énergie de la lumière fluorescente émise, et donc un déplacement vers les longueurs d’onde plus grandes («red shift») (voir Figure 2.5)
(Lakowicz, 1999).
Les sondes fluorescentes utilisées en biophysique sont souvent caractérisées par leurs larges bandes d’absorption (excitation) et d’émission. Leur structure est souvent caractérisée par des cycles aromatiques et des électrons qui peuvent être délocalisés dans la molécule. Lors de notre étude, nous avons utilisé les composés fluorescents tétramethylrhodamine-5(ou -6)-maléimide, fluorescéine-5-maléimide et Alexa fluor 488- C5-maléimide (voir Figure 6.1 pour les structures du TMR5M et TMR6M). Des filtres passe-bande (10 nm) sont utilisés pour l’excitation et la collecte de la lumière fluorescente, suivant le maximum d’absorption et d’émission des sondes utilisées.
2.6.1 Fluorométrie en condition de voltage imposé
Le défi à relever en fluorométrie en condition de voltage imposé est d’augmenter le ratio signal/bruit de la mesure de fluorescence effectuée sur un ovocyte vivant afin de pouvoir faire des mesures d’une durée raisonable, et ce pendant que l’on fait varier la conformation de SGLT1 situé à la membrane plasmique de l’ovocyte par un changement de potentiel membranaire. Dans la première partie du projet (Chapitre 3), nous avons utilisé une lampe à arc au xénon (175 W) comme source d’excitation et des tubes photomultiplicateurs (PMT) (Hamamatsu, R1527P) pour détecter la lumière fluorescente. La lumière provenant de la source était dirigée sur le miroir dichroïque grâce à une fibre optique. Le PMT capte un signal fluorescent avec une constante de temps de l’ordre de 2.2 ns, ce qui est largement plus rapide que ce que nous demandons (~ms). Par contre, ce PMT était très sensible au bruit de fond; la lumière non spécifique qui l’atteignait, sans ovocyte dans le parcours optique, était du même ordre de grandeur que le signal que nous désirions mesurer. De plus, le bruit sur la mesure de la lumière non spécifique qui atteignait les PMT était d’environ 5-10%. Le signal spécifique pour un marquage significatif d’un ovocyte exprimant un mutant où une cystéine avait été introduite était de l’ordre de deux fois le signal non spécifique obtenu en traitant les ovocytes exprimant la protéine sauvage marqué dans les mêmes conditions. Notre mesure brute de fluorescence comportait un bruit d’environ 5-10% de notre signal, nous devions donc effectuer une moyenne d’au moins une centaine de mesures pour un voltage donné pour obtenir une résolution d’au mieux 0,5 % dans le signal de fluorescence. Les données étaient par la suite filtrées (200 Hz passe-bas).
Nous avons changé simultanément la source d’excitation et le système de détection de la fluorescence pour la dernière partie du projet (Chapitre 6). Deux raisons ont motivé ce choix : les photodiodes ont un meilleur ratio signal/bruit lorsque l’intensité de lumière est très grande par comparaison avec les PMT et les lampes halogènes sont reconnues pour leur excellente stabilité, lorsqu’utilisées avec une source de voltage contrôlée. La constante de temps de la photodiode pour capter la lumière fluorescente est de 26 ns. Avec la lampe halogène (30 W) placée directement derrière le filtre d’excitation, i.e. sans fibre optique, et les photodiodes (PIN-020A, UDT Sensors), nous avons obtenu le même niveau de bruit (0.5%) avec une seule mesure pour un voltage donné.
Figure 2.6 : Chemin optique de la lumière dans le montage de spectrofluorométrie en condition de voltage imposé.
Voir texte ci-dessous pour la signification des lettres.
La Figure 2.6 illustre le trajet optique de la lumière dans notre système. Dans notre système, une lumière blanche provient d’une source de lumière (A), qui est soit une lampe à arc au xénon ou une lampe halogène. Les longueurs d’onde d’excitation sont sélectionnées par un filtre d’excitation (C), précédé d’un obturateur (B) qui est utilisé pour réduire le photoblanchiment (ou photo-extinction, «quenching»). La lumière d’excitation
est réfléchie par un miroir dichroïque (D) puis traverse l’objectif (E) du microscope inversé. Le miroir dichroïque réfléchit la lumière ayant des longueurs d’onde inférieures à une certaine valeur et transmet la lumière ayant des longueurs d’onde supérieures. En position D, il réfléchit la lumière d’excitation et transmet la lumière fluorescente provenant de la sonde. En position G, il divise la lumière fluorescente de telle sorte que la fluorescence de la sonde TMR5M soit dirigée vers le détecteur K et celle de la sonde Alexa488 vers le détecteur I. La membrane de l’ovocyte, qui lui est placé dans un bain sous perfusion et empalé par les électrodes d’électrophysiologie, est excitée par la lumière d’excitation. La lumière fluorescence émise par la sonde traverse l’objectif et le miroir dichroïque (D), puis rejoint le système de détection, qui comprend un second miroir dichroïque (G), des filtres d’émission (H, J) qui sélectionnent la lumière fluorescente désirée. Les détecteurs, des tubes photomultiplicateurs ou des photodiodes (I, K), sont placés derrière les filtres et captent ensuite la lumière qui sera enrigistrée par le système d’acquisition.