Bref survol historique

Dans les années 1960, Crane a postulé que le gradient des ions Na+ de part et d’autre de la membrane apicale des cellules épithéliales de l’intestin jouait un rôle dans le transport du D-glucose (Crane, 1965). Le transport de D-glucose couplé au Na+ de l’intestin grêle fut le premier système reconnu en tant que transport secondairement actif.

De 1974 jusqu’au milieu des années 1980 (Murer et Hopfer, 1974; Semenza et al., 1984), la majorité des études du cotransporteur de Na+/glucose se faisaient sur des vésicules de membranes de bordures en brosse (BBMV) provenant de l’intestin grêle ou du rein. De nombreux laboratoires ont développé des approches telles : 1) la solubilisation/reconstitution (Crane et al., 1976), 2) le marquage semi-sélectif (Klip et al., 1980), 3) la purification négative (Klip et al., 1979), 4) le marquage par photo-affinité (Gibbs et al., 1982), 5) la solubilisation et l’isolation utilisant les anticorps monoclonaux (Schmidt et al., 1983) et 6) l’inactivation par radiation des membranes en bordure en brosse (Turner et Kempner, 1982). Leur but principal était l’identification moléculaire du transporteur de Na+ et de glucose et la détermination de son poids moléculaire. La faible densité de transporteurs (de 7-30 pmol/mg protéines pour les membranes rénales à 50-250

pmol/mg protéines pour les membranes de l’intestin grêle), l’hétérogénéité des systèmes et le fait que les résultats étaient souvent non reproductibles furent autant de difficultés rencontrées pour la majorité des laboratoires. Les poids moléculaires estimés varièrent donc de 52 kDa (Ducis et Koepsell, 1983) à 165 kDa (Malathi et al., 1980; Malathi et Preiser, 1983), mais au moins deux méthodes établirent un poids moléculaire de 72 kDa (Hosang et

al., 1981; Schmidt et al., 1983) pour le cotransporteur.

La compréhension complète du mécanisme de fonctionnement du cotransporteur Na+/glucose requiert l’identification des acides aminés formant les sites de liaison pour le Na+, le glucose, la Pz ainsi que celle des changements de conformation qui se produisent lors du transport des substrats. Certains groupes ont étudié l’effet d’agents pharmacologiques connus pour leurs propriétés réactives (spécifique aux thiols, aux résidus arginine, lysine, phénylalanine ou tyrosine) mais le glucose, la Pz ou même le Na+ _{ont eu} peu d’effets de protection. En effet, on peut penser que si un des substrats du cotransporteur protège contre un effet observé, le(s) acide aminé(s) affecté(s) par l’agent réactif ne peuvent être que dans le site de liaison lui-même ou être essentiel pour engendrer un changement de conformation qui protège ce site lorsque le(s) substrat(s) est présent. Malheureusement, ces essais n’ont pas fourni d’informations très précises sur la nature des résidus formant les sites de liaisons pour les substrats de SGLT1.

Certaines caractéristiques fonctionnelles du transporteur avaient aussi été évaluées. Par exemple, le transporteur discrimine entre le D-glucose versus le L-glucose. La valeur de l’affinité apparente pour le D-glucose a été mesurée entre 0.1 à 2 mM selon le système utilisé, indépendante du pH entre 6.5 et 9.5 mais 5 fois plus grande à pH 5.5 (Kessler et al., 1978; Toggenburger et al., 1978; Kessler et Semenza, 1983). La phlorizine (Pz), inhibiteur compétitif non transporté de ce système de transport du glucose, est également connu depuis les années 1960 (Giraldez et Larralde, 1960; Diedrich, 1961) et sa constante d’inhibition était évaluée à 4-10 µM. Par ailleurs, l’absence d’effet du voltage sur le taux de dissociation de la Pz sur le transporteur a emmené Toggenburger et ses collègues (Toggenburger et al., 1978) à poser l’hypothèse que le complexe Pz-Na+-cotransporteur soit neutre.

Figure 1.12 : Structure chimique du β-D-glucopyranosyl (Glc) et de la phlorizine (Pz).

Un des problèmes majeurs des systèmes de vésicules des BBMV était la possibilité de la coexistence de transporteurs ayant des caractéristiques différentes (telles que des stœchiométries Na+ : glucose soit de 1:1 soit de 2:1) avec des proportions diverses dans les organes étudiés. En effet, dans l’intestin grêle, la dépendance en Na+ extracellulaire de l’influx de glucose est hautement sigmoïdale ce qui suggère une stœchiométrie de 2 Na+ : 1 glucose. Pourtant, en présence d’un gradient de voltage, cette sigmoïcité n’était pas observée. L’existence de deux cotransporteurs ayant des stoechiométries distinctes, ainsi que des affinités pour le glucose et la Pz différentes pouvait expliquer la variabilité des résultats dans les différents laboratoires à cette époque.

Il fallut attendre la fin des années 1980 (Lapointe et al., 1986) et le clonage de SGLT1 par expression dans les ovocytes de Xenopus laevis (Hediger et al., 1987) pour que des premières études en électrophysiologie soient effectuées (Umbach et al., 1990; Parent

et al., 1992a, b; Panayotova-Heiermann et al., 1994; Panayotova-Heiermann et al., 1995).

Depuis le clonage, de nombreuses études de mutagenèse et de caractérisation en électrophysiologie ont eu pour but d’établir la nature moléculaire des sites de liaison des ions Na+ et du glucose (Panayotova-Heiermann et al., 1996; Panayotova-Heiermann et al., 1997; Panayotova-Heiermann et al., 1998; Panayotova-Heiermann et al., 1999; Panayotova-Heiermann et Wright, 2001; Quick et al., 2001) et seront abordés plus loin.

La topologie des 664 acides aminés de SGLT1 (donc un poids moléculaire d’environ 75 kDa) établissant les portions de la protéine enfouies dans la membrane ou exposées aux milieux extra- et intracellulaire, a d’abord été établie par le profil d’hydropathie dès le clonage (Hediger et al., 1987) et fut modifiée par la suite (Hediger et

al., 1987; Hirayama et Wright, 1992; Turk et al., 1994, 1996 ; Turk et Wright, 1997). La

topologie avec 14 STM a été proposée en 1996 par Turk et al. et n’a été contestée (Lin et

al., 1999) que tout récemment. La structure tridimensionnelle de SGLT1 ainsi que

l’assemblage des STM sont inconnus.

Figure 1.13 : Topologie membranaire du cotransporteur Na+/glucose SGLT1.

Des chiffres indiquent la position des acides aminés, qui sont représentés par des cercles noirs avec le symbole à une lettre des acides aminés. Les cystéines endogènes sont représentées par des cercles verts.

Dès 1992, un modèle cinétique de transport fut proposé pour expliquer les divers aspects du mécanisme de fonctionnement de SGLT1 (Parent et al., 1992b), connus ou non avant son clonage. Plus tard, le modèle cinétique a évolué grâce à une technique électrophysiologique à résolution temporelle extrêmement précise par rapport au phénomène étudié (0.2 µs), le «cut-open» ovocyte (Chen et al., 1996). Le modèle proposé par Chen et ses coauteurs comportait un état intermédiaire entre les états du transporteur vide faisant face au milieu intra- et extracellulaire tel que proposé par Parent et ses coauteurs (1992b). Cela fut confirmé par d’autres études sur l’isoforme de lapin par Krofchick et ses coauteurs (Krofchick et Silverman, 2003; Krofchick et al., 2004) et plus récemment, sur l’isoforme humain (Loo et al., 2005).

Par ailleurs, il convient de noter dans un bref historique de SGLT1 une idée originale de Loo et ses coauteurs (1996) qui a marqué le domaine du transport épithélial. L’idée était que SGLT1 effectuait un transport secondairement actif de 2 Na+ par molécule de glucose et que 250 molécules d’eau étaient entraînées dans le processus. C’est l’hypothèse de l’existence d’un transport secondairement actif d’eau. L’existence des aquaporines et leur rôle dans le transport de l’eau à travers les membranes lipidiques ont été démontrés brillamment depuis maintenant un peu plus d’une décennie (Zeidel et al., 1992; Verkman et Mitra, 2000; Agre et Kozono, 2003; Verkman, 2005). Dans les années 1990, l’hypothèse du cotransport actif de l’eau par des protéines membranaires a été soulevée, puis a été appuyée par plusieurs articles concernant entre autre SGLT1 et d’autres cotransporteurs couplés au Na+ (Loo et al., 1996; Meinild et al., 1998; Meinild et al., 2000; MacAulay et al., 2001). Cette hypothèse venait briser un dogme bien établi en biologie, soit celui que l’eau ne puisse diffuser que passivement à travers une membrane i.e. sous l’effet d’un gradient osmotique (Δπ) et/ou hydrostatique (ΔP). Les mesures expérimentales qui pouvaient corroborer l’hypothèse du cotransport actif étaient : 1) un gonflement cellulaire rapide sous l’effet du transport de soluté chez les cotransporteurs, plus rapide que celui engendré par des canaux ioniques tels la gramicidine ou les canaux K+ (ROMK), 2) la stœchiométrie du transport dépend du cotransporteur, 3) l’énergie d’activation du «cotransport d’eau» et du cotransport de Na+/glucose sont similaires et 4) le transport d’eau est possible contre un gradient osmotique. De plus, la phlorizine inhibe ce «cotransport». Pourtant, tous ces arguments peuvent être discutés et réinterprétés selon l’hypothèse d’accumulation locale de solutés engendrée par SGLT1 (Duquette et al., 2001; Lapointe et

al., 2002; Gagnon et al., 2004; Charron et al., 2006). En effet, à chaque cycle de transport,

SGLT1 enrichit le milieu intracellulaire de 2 ions Na+ et d’une molécule de glucose. Tous les résultats expérimentaux ont pu être expliqués par un modèle de diffusion intracellulaire des ions et du glucose. Le cotransport actif d’eau n’est pas nécessaire pour expliquer le gonflement cellulaire associé à l’activation de SGLT1.