Aspects moléculaires et physiologiques

SGLT1 est exprimé dans les cellules de bordure en brosse des épithélia de l’intestin (Hediger et al., 1987) et du rein (Coady et al., 1990), principalement dans l’intestin grêle et dans tubule proximal. La présence de son ARNm (et hypothétiquement de la protéine active) est aussi détectable dans le cœur, la trachée, les testicules et la prostate (Zhou et al., 2003). Dans l’intestin, son rôle principal reste l’absorption du glucose provenant de l’alimentation. Dans le rein, il effectue la réabsorption du glucose du sang, qui est filtré par

les néphrons et qui retournera dans l’organisme. Dans les autres types cellulaires, on croit que sa présence peut être importante afin d’absorber du milieu extracellulaire le glucose lorsqu’il n’est présent qu’en très petite quantité.

L’énergie du potentiel électrochimique du Na+, provenant du gradient de concentration et du potentiel membranaire, permet d’effectuer ce travail de façon très efficace. La concentration de glucose dans le plasma est régulé autour de 5 mM et comme sa sortie des cellules rénales ou intestinales est passive, le glucose intracellulaire doit être égal ou au dessus de 5 mM. La pompe Na+/K+ ATPase basolatérale maintient le gradient des ions Na+ et le glucose est transporté passivement à travers la membrane basolatérale par des transporteurs facilités de glucose de la famille des GLUT vers le sang (pour revues voir Brown, 2000; Wood et Trayhurn, 2003).

1.4.3.1 SGLT1, SGLT2 et SGLT3

Il existe trois transporteurs de Na+ et de glucose parmi la famille SLC5 : SGLT1, SGLT2 et SGLT3. SGLT1 et SGLT2 sont exprimés principalement dans le rein et l’intestin et se distinguent par leur stœchiométrie : SGLT1 utilise deux ions Na+ par molécule de glucose et SGLT2 utilise un ion Na+ par molécule de glucose. Leur affinité pour le substrat est très différente : SGLT1 a une haute affinité pour le glucose (~0.4 mM chez l’isoforme humain) tandis que SGLT2 a une faible affinité (2 mM). Ces deux membres de la famille SLC5 ont environ 75% d’identité dans leur séquence en acides aminés. Peu de travaux en électrophysiologie ont été faits sur SGLT2 puisque son expression dans les ovocytes de

Xenopus est faible (Mackenzie et al., 1996). SGLT3 a fait l’objet d’une controverse puisque

sa fonction s’avère différente selon l’espèce, et le type cellulaire dans laquelle il se trouve, et ce, malgré sa forte identité avec SGLT1 (hSGLT3 est 70% identique à hSGLT1). L’isoforme du porc semble avoir une fonction similaire à SGLT1, celle de transporter du glucose (Kmglc 6 mM, voir Tableau I.I) en utilisant le gradient électrochimique du Na+ et ce, avec la même stœchiométrie que SGLT1 (Chen et al., 1995; Diez-Sampedro et al., 2001). Par contre, chez l’isoforme SGLT3 humain, il n’y a pas de transport de glucose, malgré que le transport de Na+ soit toujours présent et stimulé par le glucose de façon dose-dépendante. L’affinité pour le glucose telle que mesurée par le déplacement du potentiel membranaire

causé par le glucose serait de 19 mM (hSGLT3) et la protéine semble s’exprimer dans les nerfs de l’intestin et du muscle squelettique où il agirait comme senseur de glucose afin de réguler l’activité musculaire.

Tableau I.I : Caractéristiques fonctionnelles de hSGLT1, hSGLT2 et pSGLT3. Tiré de (Wright, 2001). hSGLT1 hSGLT2 pSGLT3 K0.5D-glucose (mM) 0.4 2 6 K0.5Na+(mM) 3 100 1.5 KiPz (μM) 0.22 1 9 Couplage (Na+:glucose) 2 (1) 2

Sélectivité des sucres D-glc~D-gal D-glc»D-gal D-glc»D-gal

Na+ leak oui non oui

Nombre d’acides aminés

664 672 659

1.4.3.2 Syndrome de malabsorption du glucose et du galactose (GGM)

Le syndrome de malabsorption du glucose et du galactose (GGM) est une maladie génétique puisqu’il est dû à un mauvais fonctionnement du cotransporteur de Na+ _{et de} glucose SGLT1. Le syndrome GGM est un désordre génétique récessif associé à des symptômes graves tels la diarrhée et la déshydratation, qui peuvent causer la mort chez les patients atteints si le glucose et le galactose ne sont pas complètement éliminés de leur alimentation (pour revue voir, Wright et al., 2002). Les sucres simples tels le glucose et le galactose proviennent de la dégradation du lactose du lait par un enzyme dans l’intestin. Ces sucres sont ensuite transportés dans les cellules par SGLT1 puis dans le sang via les GLUT et l’eau est absorbée parallèlement à l’absorption des sucres pour le maintien de

l’osmolarité des cellules. Lorsque SGLT1 ne fonctionne pas, les sucres et l’eau restent dans l’intestin et causent ainsi la diarrhée, c’est dire l’importance physiologique de SGLT1.

Le GGM chez l’homme a permis d’identifier des mutations dans SGLT1 qui engendrent une forte diminution de l’activité de la protéine souvent mais pas toujours associée à mauvais acheminement à la membrane plasmique (Turk et al., 1991; Martin et

al., 1996a, b; Lam et al., 1999; Wright et al., 2002). Plus de 30 mutations ont été identifiées

dans les gènes de plusieurs familles de patients atteints du syndrome. La majorité de ces mutations sont des mutations ponctuelles qui modifient la nature d’un acide aminé pour un autre (ex : D28N, A166T, C292Y, C255W, D273G, C355S, Q457R, pour ne nommer que celles-là). Il existe aussi un petit nombre de mutations qui modifient le cadre de lecture ou introduisent un codon stop et donc, engendrent une protéine incomplète et/ou qui n’est pas acheminée à la membrane plasmique par le système des vésicules de transport et/ou qui n’est pas fonctionnelle.

1.4.3.3 Syndrome familial de glucosurie rénale (FRG)

Le syndrome familial de glucosurie rénale est quant à lui associé au gène codant pour SGLT2 (Calado et al., 2004, 2006; Francis et al., 2004; Kleta et al., 2004; Magen et

al., 2005). La glucosurie rénale se caractérise par une excrétion excessive de glucose dans

l’urine malgré une glycémie normale. L’identification de patients atteints ayant des mutations dans ce gène (ex : K321R, A102V, T200K, N654S) a prouvé hors de tout doute l’importance du rôle de SGLT2 dans la physiologie rénale et son implication dans cette pathophysiologie.

Jusqu’à présent, aucun patient présentant une pathologie impliquant des mutations dans le gène de SGLT3 n’a été identifié. Nous pouvons parier quant à l’importance d’une telle découverte future pour la compréhension de son rôle exact.

1.4.3.4 Site de liaison pour le glucose, la Pz et les ions Na+

Nous en savons relativement peu sur les sites de liaison des ions Na+, du glucose et de la phlorizine. Panayotova-Heiermann et ses coauteurs (1996) ont d’abord remarqué

qu’une enzyme pouvait couper l’ADN de SGLT1 à peu près en son centre. Ils ont exprimé la portion carboxy terminale dans les ovocytes de Xenopus et ils ont remarqué de façon totalement inattendue que la perméabilité au glucose était très significativement augmentée par rapport à celle mesurée chez les ovocytes non-injectés (20 fois plus grande) avec une certaine sélectivité (αMG > D-glucose > D-galactose >> L-glucose ≈ D- mannose). Le transporteur tronqué se comportait comme une perméase qui laissait passer le glucose mais aussi le mannitol (un composé neutre normalement non transporté par SGLT1) de façon indépendante des ions Na+. De plus, le transport de sucres dans ce pore était inhibé par la phlorétine (un inhibiteur des GLUT) tandis que l’inhibition par la Pz était totalement éliminée par cette troncation. Ces auteurs ont conclu que le site de liaison du glucose de SGLT1 était située dans la portion carboxy terminale de la protéine (Panayotova-Heiermann et al., 1996, 1997). Ces caractéristiques fonctionnelles (l’absence de dépendance pour les ions Na+, la perméabilité au mannitol, l’inhibition par la phlorétine et non par la Pz) sont si différentes de celles de SGLT1 qu’un doute peut être soulevé sur la signification donnée par le groupe de Wright à ce résultat, nommément que le site de liaison du glucose se situe dans la portion carboxy terminale de la protéine. Par ailleurs, le résidu Q457 semble quant à lui important dans le transport de glucose car lorsqu’il est muté en arginine (mutant Q457R) il engendre le syndrome GGM quoique la protéine soit correctement acheminée à la membrane plasmique (Wright et al., 2002). L’affinité pour le glucose du mutant Q457C est largement perturbée : elle serait de 6 mM selon les expériences en électrophysiologie (Loo et al., 1998) et de 38 mM selon les expériences de fluorescence avec la sonde TMR6M (Meinild et al., 2002) (sur lesquelles nous reviendrons plus loin dans la section 1.4.7) i.e. au moins un ordre de grandeur plus élevée que celle du wt SGLT1 humain. Les agents oxydants MTSET, MTSES et MTSEA abolissent le transport de glucose dans le mutant Q457C de même que le fluorophore TMR6M, ce qui indique que la présence d’un groupement d’atomes supplémentaire à cet endroit empêche le transport de glucose, et que cela n’a pas de lien avec la charge de ce groupement. La présence d’une charge en position 454 semble aussi être importante pour le transport de glucose puisque la mutation D454C produit une réduction de 97% du transport de sucre, de 95% de la charge transférée, mais n’a eu que peu d’effet sur l’affinité pour l’αMG (0.6 mM), telle que mesurée avec le changement de fluorescence encouru par le TMR6M

attaché à cette position en fonction de la concentration d’αMG (Diez-Sampedro et al., 2004). Cependant, la réaction du MTSES (mais non du MTSET) sur cette cystéine nouvellement introduite a causé une augmentation modeste du transport de sucre (Diez- Sampedro et al., 2004). Par ailleurs, lorsque l’acide aminé D454 est muté en histidine, il semble que la stoichiométrie du transport soit de 3 Na+ : 1 glucose à pH 5.5 et de 2 Na+ : 1 glucose à pH 7.5, suggérant que cet acide aminé soit important dans le couplage Na+/glucose (Diez-Sampedro et al., 2004). Bref, le site de liaison du glucose n’est pas établi hors de tout doute mais pourrait être situé près du résidu Q457 dans hSGLT1.

D’autre part, Novakova et ses coauteurs (2001) ont quant à eux formulé l’hypothèse que les résidus 604 à 610 formaient une partie du site de liaison de la phlorizine. Cette hypothèse fut formulée à partir de résultats de mutagenèse de résidus de la boucle entre les segments transmembranaires 13 et 14, faites dans SGLT1 de lapin exprimé dans des cellules COS-7. Ils ont déterminé que leurs mutations affectaient le KiPz sans affecter le

KmαMG. Pour corroborer leur hypothèse, ils ont ensuite isolé et purifié un peptide d’une centaine d’acides aminés correspondant à cette boucle de SGLT1 de lapin (Raja et al., 2003; Xia et al., 2003; Xia et al., 2004). Ils ont mesuré la fluorescence des tryptophanes présents dans leur peptide en présence et en absence de Pz. Comme la présence de Pz perturbait la fluorescence des tryptophanes, ils ont conclu à une interaction démontrant une affinité de 23 µM pour la boucle wt et de 57 µM pour la boucle mutante G609K. La Pz possède une moitié identique au glucose et deux anneaux aromatiques reliés par un alkyl (voir Figure 1.12). Comme l’inhibition produite par la Pz est compétitive par rapport au glucose, il est fort probable que son site de liaison soit formé en partie par le site de liaison du glucose et d’une autre région de SGLT1. À notre avis, les indications que les résidus 604 à 610 forment le site de liaison de la Pz sont faibles et il nous semble un peu naïf et certainement prématuré de croire que le site de liaison de la Pz est conservé lorsque la boucle 13-14 est exprimée en absence du reste de la protéine.

Lo et Silverman (1998a) ont d’abord spéculé que les acides aminés formant la boucle extracellulaire entre les segments transmembranaires IV et V (résidus 162 à 173) forment le site de la liaison des ions Na+ et participeraient à la sensibilité au voltage membranaire. Ils ont mesuré des modifications dans la valeur du KmαMG chez certains

mutants (F163C 0.58 mM, A166C 0.90 mM, T172C 0.35 mM vs. 0.15 mM pour wt rSGLT1) sans tester si ces modifications étaient dues à un changement dans l’affinité apparent pour les ions Na+. Il serait en effet attendu qu’une mutation qui met en jeu des résidus formant directement le site de liaison du Na+ modifie l’affinité apparente pour cet ion et, de façon indirecte l’affinité pour le glucose. Par ailleurs, certains de leurs mutants se sont montrés sensibles aux réactifs MTS : le Icotr de F163C et A166C est inhibé par le MTSEA et le Ileak de L173C est inhibé par MTSEA. Leur courbe de charge transférée (courbe Q-V) est aussi déplacée de -10 à -18 mV par la présence d’une charge positive (MTSEA) sans que la pente de la courbe soit affectée. La spéculation concernant le rôle de cette boucle dans la formation du site de liaison pour les ions Na+ a été reprise et admise comme un fait établi dans une étude subséquente de ce groupe (Huntley et al., 2004). Il nous apparaît incroyable que l’on puisse prétendre qu’un segment de SGLT1 soit impliqué dans le site de liaison du Na+ _{sans jamais avoir montré les effets de mutations dans cette} région sur l’affinité même du Na+. Il nous semble que d’autres mutations ont montré des effets importants sur l’affinité au Na+. Par exemple, la neutralisation du résidu K321 dans le STM VIII de SGLT1 engendre une réduction dramatique du transport de glucose, une modification de l’affinité apparente pour le Na+ (70 vs. 3 mM, chez SGLT1 de lapin) ainsi qu’un déplacement de +50 mV la courbe de charge transférée (Panayotova-Heiermann et

al., 1998). Les auteurs ont conclu que ce résidu participait directement ou indirectement à

l’établissement de l’affinité pour les ions Na+. En bref, les tentatives expérimentales ayant pour but d’établir la nature exacte des résidus qui participent au site de liaison des deux ions Na+ n’y sont pas encore parvenues de façon persuasive.