Les extrémités extracellulaire et périplasmique du canal OprN

OprN, tout comme les autres OMFs, présente une extrémité extracellulaire qui ouvre le domaine β transmembranaire sur le milieu extracellulaire et une extrémité périplasmique

Gln146 Pro445 Trp443 Glu139 Glu136 Leu142 Leu64 Leu57 Phe61 His448 His449 His450 His451

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d’OMFs résolues en conformation ouverte (TolC, MtrE), la structure d’OprN a été résolue en conformation fermée (Fig. 80).

Figure 80 : Représentation des extrémités extracellulaire (EE) et périplasmique (EP) d’OprN (A), de TolC (B) et de MtrE (C). La comparaison des extrémités d’OprN avec celles de TolC ou de MtrE montre que le canal est en

conformation fermée. Les trois monomères sont représentés en magenta, en cyan et en vert.

Du côté extracellulaire, les résidus 94-102 de chaque monomère forment une boucle flexible entre les brins β S3 et S4. Les boucles des trois monomères ferment l’extrémité du domaine β par une interaction de van der Waals au niveau des trois résidus Val98 (Fig. 81). Ce résidu n’est ni conservé au sein des OMFs de P. aeruginosa, ni conservé chez les bactéries Gram négatif. Il est remplacé par un résidu polaire chez OprM (Thr105) et un résidu aliphatique (Gly271) chez TolC (Fig. 81). Ce résidu réduit le diamètre de l’extrémité extracellulaire à un pore d’environ 3 Å, contrairement à la structure de TolC qui présente un canal plus ouvert de diamètre 6 Å. Les substrats de la pompe MexEF-OprN tels que la ciprofloxacine sont plus larges que ce pore. L’efflux des substrats implique donc une

B C

A

EE

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Elles semblent donc impliquées dans la sortie des substrats au cours de l’efflux, mais sont surtout supposées jouer le rôle de gardien de l'influx, les protéines OMFs n'étant pas supposées constituer une porte d'entrée vers l'intérieur de la cellule.

Le diamètre interne du canal est de 35 Å et ce diamètre est relativement constant du domaine β au domaine équatorial. L’ouverture du canal se réduit progressivement à partir du domaine équatorial pour s’obturer complétement au niveau de l’extrémité périplasmique à cause de la torsion des hélices internes (H4 et H8) et des hélices externes (H3 et H7).

L’ouverture et la fermeture du canal au niveau de cette extrémité sont régulées par un réseau de liaisons hydrogène et de ponts salins inter- et intramonomériques formés par des résidus présents à l’extrémité des quatre hélices du domaine coiled-coil de chaque monomère. Ce réseau est constitué de résidus polaires et chargés (Asp197, Arg396, Tyr397, Thr402, Asp409, Arg412). Ces résidus sont conservés au sein des OMFs chez P. aeruginosa mais également chez E. coli, à l’exception de la thréonine Thr402 d’OprN qui est remplacée par un aspartate, Asp409 chez OprM et par une glycine, Gly365 chez TolC (Fig. 81).

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Figure 81 : Représentations des extrémités de différentes OMF. Les résidus impliqués dans la fermeture de

l’extrémité extracellulaire (panneau supérieur) sont indiqués en vert pour OprN, en jaune pour OprM et en cyan pour TolC. Le cercle violet matérialise l’ouverture et le diamètre du pore formé par ces résidus. Le panneau inférieur montre les résidus impliqués dans la fermeture périplasmique. Les résidus impliqués dans le réseau de liaisons hydrogènes et de ponts salins inter- et intramonomériques qui stabilisent la conformation fermée sont représentés par des sphères. L’un des trois monomères est représenté en couleur brique.

Néanmoins, le niveau de constriction maximale est localisé à l'extrémité du canal, et implique pour les trois protéines considérées des résidus hydrophobes (Fig. 82). Chez OprM et OprN, cet acide aminé est conservé et correspond à une Leucine, là où une Valine est présente chez TolC.

TolC Val98 3 Å Arg396 Tyr397 Asp197 Thr402 Thr105 3 Å Tyr404 _Arg403 Asp409 Asp205 Gly271 6 Å Arg367 Asp153 Tyr362 Gly365

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Figure 82 : Représentation du triplet de résidus hydrophobes conservés de la constriction périplasmique d’OprN, OprM et de TolC. L’un des monomères est représenté en couleur brique.

Il est à noter, grâce à des travaux réalisés par Anderson et al. (Andersen & al, 2002) sur TolC, que les résidus jouant un rôle important dans l'ouverture de TolC ne se limitent pas à ceux se trouvant à cette extrémité périplasmique, mais impliquent également des résidus localisés plus haut sur les hélices. En plus des résidus TolC-Asp153 et TolC-Tyr362 dont nous avons déjà parlé, qui forment une liaison hydrogène entre l’hélice externe H7 et l’hélice interne H4, ils ont identifié les résidus TolC-Gln136 et TolC-Glu359, formant une liaison hydrogène entre les hélices externes H3 et H7, comme acteur de l'ouverture. L’interaction Asp-Tyr est conservée chez OprN (Fig. 83) ce qui n'est pas le cas pour l’interaction Gln-Glu. Le résidu TolC-Gln136 est remplacé par Ser180 et le résidu TolC-Glu359 par OprN-Ala394, ne permettant pas la formation de cette liaison. Cette interaction est cependant maintenue chez son homologue OprM, qui conserve la liaison hydrogène grâce aux résidus OprM-Ser188 et OprM-Asp401. Chez OprN, cette interaction est assurée par les résidus Arg387-Asn173 (Fig. 83). Ces interactions entre les résidus de l’hélice internes H4 d’un monomère et l’hélice externe H7 du monomère voisin contribuent à stabiliser la conformation fermée.

Leu405

Leu412

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Figure 83 : Représentation des résidus qui stabilisent la conformation fermée chez OprN au sein d’un monomère (A) et entre deux monomères, représentés en marron et en bleu (B).

Les monomères d'OprN sont majoritairement stabilisés par des interactions hydrophobes dans cette région (Ala203 - Ala385, Leu199 - Ala389). Chez OprM, ces résidus correspondent à Thr211 - Ala392 et Arg207 - Tyr396. Le lien supérieur reste donc hydrophobe, mais l’interaction Leu-Ala n’est pas conservée. La conformation fermée d’OprN semble donc être stabilisée par des interactions différentes de celles observées chez ses homologues. Il sera intéressant de caractériser le rôle de l'ensemble de ces interactions pour étudier le mécanisme d’ouverture du canal.

Enfin, à l'extrémité interne du canal, un anneau anionique formé par les résidus Asp371 et Asp374 a été identifié chez TolC. Cet anneau a été décrit comme étant un filtre à cations au sein du canal au cours de l’efflux (voir Chapitre I.4.1.2). Cet anneau n'existe pas chez les protéines de Pseudomonas considérées, car même si le résidu TolC-Asp371 est conservé chez OprN (Asp409) et chez OprM (Asp416), le résidu TolC-Asp374 y est remplacé par une arginine (OprN-Arg412 et OprM-419) (Fig. 84). Les charges sont donc inversées, menant à la formation d'un pont salin à la place du filtre ionique de TolC, impliquant des différences de comportement dans les mécanismes d'ouverture de ces différentes protéines.

Arg387 Tyr397 Leu183 Asn173 H3 H4 H8 H7 Ala203 _Ala385 Leu199 ^Ala389 H3 H3 H4 H4 H7 H7 H8 H8

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Figure 84 : Vue de la constriction périplasmique d’OprN.

Afin d'identifier les résidus réellement importants dans l'ouverture parmi ceux décrits dans ce chapitre, nous avons muté un certain nombre d'entre eux chez OprM, dont la structure avait été précédemment résolue (Phan & al, 2010) et étudié leur phénotype de résistance chez Pseudomonas par des expériences de complémentation qui seront décrites dans le paragraphe 3.