MATERIEL ET METHODES
1.3.4. Clonage d’OprM et de ses mutants dans le vecteur pUCP24
Certains résidus supposés impliqués dans l’ouverture périplasmique du canal OprM ont été mutés et sept mutants ont été générés : quatre mutants simples (R403L, Y404F, D416A, R419A), deux mutants doubles (R403L-Y404F et D416A-R419A) et le quadruple mutant décrit en 1.3.1.1 (R403L-Y404F-D416A-R419A). Ces versions mutées du gène oprM ont été clonées dans le vecteur pME6001, vecteur navette compatible avec une expression stable des protéines chez Pseudomonas aeruginosa pour réaliser des études fonctionnelles
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vecteur présente cependant l’inconvénient de surexprimer les protéines étudiées de façon basale. Nous avons donc choisi de re-cloner les gènes codant pour les formes sauvage et mutée d’OprM dans un vecteur ayant un promoteur plus faible, le pUCP24 afin de réduire l’expression des protéines à un taux physiologique. Les deux vecteurs nous ont été fournis par l’équipe du Pr Patrick PLESIAT du CHU de Besançon. Les inserts correspondants aux différentes versions du gène oprM sont amplifiés par PCR à partir des plasmides dérivés du pME6001 (pME6001-XXXX) grâce aux amorces pseudo-5’-EcoRI et OprM-pseudo-3’-SacI suivant le protocole décrit en 1.3.1.1. L’amorce 3’ permet l’insertion d’une étiquette poly-histidine utilisée ultérieurement pour la détection des protéines par western blot.
Les produits d’amplification sont digérés par la DpnI comme décrit précédemment (§1.3.1.2) puis pendant 1 h à 37 °C par les enzymes de restriction EcoRI HF et SacI HF. Les produits de digestion sont insérés dans le vecteur pUCP24 préalablement digéré par les mêmes enzymes, suivant les conditions décrites au paragraphe 1.3.1.2. La transformation et le criblage des clones positifs sont effectués comme décrit précédemment (§1.3.1.2 et §1.3.1.3), exception faite de la transformation qui est réalisée à l’aide de bactéries chimiocompétentes de la souche Stellar d’E. coli et de la sélection des clones recombinants qui est effectuée sur boîte LBG (boîte LB contenant de la gentamicine à 15 μg/mL).
Le protocole décrit en 1.3.1.1 n’a cependant pas permis d’obtenir de produit d’amplification. Nous avons voulu nous affranchir de l’éventuelle dégradation des réactifs en renouvelant les stocks de réactifs et de plasmides. Nous avons également augmenté la concentration de la matrice ainsi que la durée de l’élongation mais nos essais sont demeurés infructueux. Nous avons finalement réussi à amplifier les inserts en changeant de polymérase et en ajoutant du DMSO au mélange réactionnel. La Phusion (produite au laboratoire) qui est pourtant 50 fois plus fidèle (4 x10-7 erreurs/bp, comparativement à la Taq polymérase) et plus processive, a été remplacée par la pfu (également produite au laboratoire) qui est certes moins fidèle (1-2 x10-6 erreurs/bp, comparativement à la Taq polymérase) et 10 fois moins processive que la Phusion, mais qui reste plus thermostable (elle conserve 95% de son activité jusqu’à plus de 2 heures d’incubation à 95 °C) (McInerney, & al, 2014).
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une difficulté supplémentaire pour les clonages, favorisant la formation de structures secondaires, et nécessitant des températures de fusion plus élevées. L’addition de DMSO permet de dénaturer les matrices riches en GC. Il abaisse également la Tm des amorces, ce qui permet d’éviter la formation de structures secondaires (dimères d’amorces). Enfin, il favorise la dénaturation des structures superenroulées, rendant ainsi le plasmide plus accessible à la polymérase.
8 nouveaux plasmides ont ainsi été obtenus : wt, R403L, Y404F, D416A, R419A, OprM-R403L-Y404F, OprM-D416A-R419A et OprM-4mut. Le plasmide pUCP24-OprM-D416A présentait cependant une insertion de 18 nucléotides (18-ins) en amont de l’étiquette poly-histidine. L’insert a donc été de nouveau amplifié suivant le protocole optimisé décrit plus haut grâce au plasmide pUCP24-OprM-D416A utilisé comme matrice et au couple d’amorces OprM-pseudo-5’-EcoRI et OprM-pseudo-3’-SacI-his. La seconde amorce s’hybride de part et d’autre de l’insertion 18-ins, sur l’extrémité C-terminale du gène d’OprM d’une part, et sur l’étiquette poly-histidine d’autre part, permettant d’ôter l’insertion 18-ins non désirée.
Ces plasmides ont été utilisés pour transformer des bactéries Pseudomonas aeruginosa électrocompétentes, en vue des expériences de complémentation in vivo.
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Protéine Amorces Séquence (5' -> 3') Tm
(°C) %GC bp
OprM
OprM-5'-NdeI GGAATTCCATATGAAACGGTCCTTCCTTTCC 71 45,1 31 OprM-3'-HisXmaI TCCCCCCGGGTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGCCTGGGGATCTTCC
TTCTTCGCGGTCTG 76 60,6 61
OprM-5'-T13 TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAACGGTCCTTCC 74,4 32,6 46 OprM-3'-T13 AGCGGCTACCGCCAGGGAAAGGAAGGACCGTTTCATATGTATATCT 81,6 50 46 OprM-pseudo-5’-EcoRI GAAGTCCGGAATTCATGAAACGGTCCTTCCTTTCC 75,4 48,6 35 OprM-pseudo-3’-SacI AGCGACCGAGCTCGGTCAGTGATGGTGATGGTG 78,9 60,6 33 OprM-pseudo-3’-SacI-His TATGAGCTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGCCTGGGGATCTTCCT
TCTT 72,6 54,9 51
MexX MexX-5'-NcoI GGAGATATACCATGGATGCACATCCAATGGACCGG 76,6 51,4 35 MexX-3'-XhoI CCAAGCGCTCTCGAGCTGGCCCGCCGGCGAGGCGG 88,3 80 35
MexY MexY-5'-BsaI NNNNNNGGTCTCNGGCCGCTCGTTTCTTCATCGACCGTCCA - - 41 MexY-3'-BsaI NNNNNNGGTCTCNGCGCTGGCTTGTTCGGTCGGAATCTGCGG - - 42
Tableau 6 : Récapitulatif des amorces utilisées. Les sites de coupure des enzymes de restriction sont indiqués
en bleu, l’étiquette poly-histidine est indiquée en rouge, la séquence de l’amorce s’hybridant sur le gène d’intérêt est indiquée en gras et soulignée, les codons correspondant aux résidus mutés sont indiqués en gras et en minuscule. La Thymine 13 est indiquée par un *. La lettre N correspond à l’une des quatre bases azotées.
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Plasmides Description Inducteur Résistance Référence
pBAD33-GFPuv Vecteur d’expression dérivé du pBAD33 et du pBAD-GFP, 6613
bp L-arabinose Cm
R LCRB, Benhabdelhak
pPMMhis Vecteur dérivé du pBAD33-GFPuv portant le gène OprMhis L-arabinose CmR LCRB, Monlezun
pBAD33-OprM-2muthis Vecteur dérivé du pBAD33-GFPuv portant le gène OprMhis avec
les mutations D416A et R419A L-arabinose Cm
R LCRB, Benhabdelhak
pBAD33-OprM-4muthis Vecteur dérivé du pBAD33-GFPuv portant le gène OprMhis avec
les mutations R403L, Y404F, D416A et R419A L-arabinose Cm
R Cette étude
pPMNhis
Vecteur dérivé du pBAD33-GFPuv portant le gène OprNhis L-arabinose CmR
LCRB, Benhabdelhak
pPMAhis
Vecteur dérivé du pBAD33-GFPuv portant le gène MexAhis L-arabinose CmR
LCRB, Benhabdelhak
pPMEhis
Vecteur dérivé du pBAD33-GFPuv portant le gène MexEhis L-arabinose CmR
LCRB, Benhabdelhak
pET-22b-MexBhis
Vecteur d’expression dérivé du pET-22b portant le gène MexBhis IPTG AmpR LCRB, DEZI
pASK-IBA63 Vecteur d’expression, 3226 bp AHT AmpR IBA
pIBA63-MexXstrep
Vecteur dérivé du pASK-IBA2 portant le gène MexXStrep AHT AmpR Cette étude
pASK-IBA2 Vecteur d’expression, 3286 bp AHT AmpR IBA
pIBA2-MexYhis
Vecteur dérivé du pASK-IBA2 portant le gène MexYStrep AHT AmpR Cette étude
pMexXYhis Vecteur dérivé du pET-11a portant l’opéron synthétique
constitué de MexX et de MexYhis IPTG AmpR (Mokhonova et al., 2005)
pME6001 Vecteur de clonage et d’expression dérivé du vecteur pME6000
compatible avec E. coli et P. aeruginosa, 7425 bp - Gm
R (Blumer et al., 1999)
pME6001- OprM- wthis
Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprMhis - GmR LCRB, Monlezun
pME6001- OprM- R403Lhis Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprMhis avec la
mutation R403L - Gm
R LCRB, Monlezun
pME6001- OprM- Y404Fhis Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprMhis avec la
mutation Y404F - Gm
R LCRB, Monlezun
pME6001- OprM- D416Ahis Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprMhis avec la
mutation D416A - Gm
R
LCRB, Monlezun
pME6001- OprM- R419Ahis Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprMhis avec la
mutation R419A - Gm
R
LCRB, Monlezun
pME6001- OprM- R403L- Y404Fhis Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprMhis avec les
mutations R403L et Y404F - Gm
R
LCRB, Monlezun
pME6001- OprM- D416A- R419Ahis Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprMhis avec les
mutations D416A et R419A - Gm
R
LCRB, Monlezun
pME6001- OprM- 4muthis Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprMhis avec les
mutations R403L, Y404F, D416A et R419A - Gm
R Plateforme IMAGIF
pME6001- OprNhis
Vecteur dérivé du pME6001 portant le gène OprNhis - GmR LCRB, Monlezun
pUCP24 Vecteur de clonage et d’expression multicopies dérivé du vecteur
pUCP18 compatible avec E. coli et P. aeruginosa, 4036 bp - Gm
R (West et al., 1994)
pUCP24- OprM- wthis
Vecteur dérivé du pUCP24 portant le gène OprMhis - GmR Cette étude
pUCP24- OprM- R403Lhis Vecteur dérivé du pUCP24 portant le gène OprMhis avec la
mutation R403L - Gm
R Cette étude
pUCP24- OprM- Y404Fhis Vecteur dérivé du pUCP24 portant le gène OprMhis avec la
mutation Y404F - Gm
R
Cette étude
pUCP24- OprM- D416Ahis Vecteur dérivé du pUCP24 portant le gène OprMhis avec la
mutation D416A - Gm
R
Cette étude
pUCP24- OprM- R419Ahis Vecteur dérivé du pUCP24 portant le gène OprMhis avec la
mutation R419A - Gm
R
Cette étude
pUCP24- OprM- R403L- Y404Fhis Vecteur dérivé du pUCP24 portant le gène OprMhis avec les
mutations R403L et Y404F - Gm
R
Cette étude
pUCP24- OprM- D416A- R419Ahis Vecteur dérivé du pUCP24 portant le gène OprMhis avec les
mutations D416A et R419A - Gm
R
Cette étude
pUCP24- OprM- 4muthis Vecteur dérivé du pUCP24 portant le gène OprMhis avec les
mutations R403L, Y404F, D416A et R419A - Gm
R
Cette étude
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