Expérience de co-immunoprécipitation d'ARN

Cette expérience a été réalisée soit à partir d’extraits d’embryons âgés de 0 à 15 heures

exprimant une protéine de fusion FLAG-CortoCD (chromodomaine élargi de Corto) grâce au

pilote ubiquitaire daughterless::Gal4, soit à partir de cellules S2 exprimant de manière transitoire une protéine de fusion FLAG-Corto. Dans le premier cas, les embryons ont été fixés au paraformaldéhyde avant l’extraction protéique de manière à stabiliser les interactions moléculaires (« cross-linking »).

Fixation des embryons au formaldéhyde. Les embryons (1 gramme) sont déchorionnés

pendant 5 minutes dans un bain d'eau de javel (NaOCl 3%). Ils sont ensuite rincés abondamment avec de l'eau puis avec une solution de rinçage EWB (Triton X-100 0,03%, NaCl 0,4%) et enfin avec du PBS, Triton X-100 0,01%. La fixation est réalisée pendant 15 minutes sous agitation vigoureuse dans 10ml de solution de formaldéhyde (formaldéhyde 1,8%, HEPES 50mM, EDTA 1mM, EGTA 0,5mM, NaCl 100mM, pH8) à laquelle sont ajoutés 30ml de n-heptane. Les embryons sont ensuite centrifugés 1 minute à 9000g et 4°C et la réaction stoppée par rinçage dans 50ml de PBS 1X, glycine 0,125M, Triton X-100 0,01%. Après sédimentation sans centrifugation, les embryons sont rincés 10 minutes sous agitation dans 15ml de tampon I (HEPES 10mM pH7,6, EDTA 10mM pH8, EGTA 0,5mM pH8, Triton

X-EDTA 1mM pH8, EGTA 0,5mM pH8, Triton X-100 0,01%). Finalement, les embryons sont égouttés, congelés instantanément dans l'azote liquide et stockés à -80°C.

Extraction protéique totale à partir embryons. 1 gramme d’embryons fixés est broyé dans

3ml de tampon RIPA (50mM Tris-HCl pH7,5, 150mM NaCl, 0,5% NP40, 0,1% SDS, 50mM Tris pH7,5) supplémenté en inhibiteurs de Protéase (complete Mini, EDTA-free, Roche) ainsi qu'en inhibiteurs de RNase (RiboLock™ RNase Inhibitor, Fermentas). Le broyat est ensuite centrifugé 10 minutes à 16000g et 4°C et le surnageant contenant toutes les protéines est récupéré. La quantité de protéine est ensuite évaluée par un dosage colorimétrique avec le réactif de Bradford.

Transfection et extraction protéique totale à partir de cellules S2. 5.10⁶ cellules S2 sont transfectées avec 2µg d’ADN d’un vecteur permettant l’expression de la protéine de fusion Corto-FLAG sous contrôle du promoteur actine. Le protocole de transfection et d’extraction est identique à celui décrit dans l’article de la partie I.

Immunoprécipitation des complexes protéines/ARN. 500µg d’extraits protéiques

d’embryons ou 250 µg d’extraits protéiques de cellules S2 transfectées sont incubés toute la nuit à 4°C avec 3µg d’anticorps monoclonal anti-FLAG (M2, Sigma), ou anti-Myc (9E10, Santa Cruz) dans un volume final de 500µl de tampon RIPA. Parallèlement, 30µl de billes magnétiques couplées à la protéine G (Ademtech) sont incubés toute la nuit dans 100µl de tampon RIPA avec 10µg d’ARNt dénaturés 10min à 65°C. Le lendemain, le surnageant est retiré et les billes sont incubées 2 heures à 4°C sous agitation avec les extraits protéiques. A la fin de l’incubation, le tube est placé sur un portoir aimanté, le surnageant est conservé et les billes sont lavées cinq fois dans 300µl de tampon RIPA. Les billes sont ensuite resuspendues dans 100µl de tampon RIPA. 20µl de billes sont conservés pour vérification de

l’efficacité d’immunoprécipitation par Western-blot. Le reste est transféré dans un tube propre et soumis à une extraction des acides nucléiques.

Extraction des ARN. De manière à récupérer les acides nucléiques éventuellement

co-immunoprécipités, des extractions au Trizol® (Invitrogen) puis au chloroforme sont réalisées sur les billes. A la fin de ces extractions, la phase aqueuse est récupérée et les acides nucléiques sont précipités à l’éthanol 100% en présence de 200µg de glycogène servant d'entraîneur. Après centrifugation, le culot est rincé avec de l’éthanol 70%, séché et

resuspendu dans 20µl d’H20-DEPC.

Réaction de RT-PCR. La moitié des ARN extraits est rétro-transcrite avec des hexamères

« random » à l’aide du kit Quantitec Reverse Transcription (Qiagen), l’autre moitié est traitée de la même façon mais l’enzyme de rétro-transcription est omise afin de réaliser un contrôle de contamination par l’ADN génomique. Dans le cas de l’analyse des brins sens et anti-sens de MP1, la réaction de rétro-transcription a été réalisée à l’aide du kit Superscript II (Invitrogen), permettant de réaliser la réaction en plusieurs étapes et d’ajouter des oligonucléotides spécifiques des brins sens (MP1down) et anti-sens (MP1T4), ou à l’aide du kit Sensiscript® (Qiagen). Avec ce dernier, la température de réaction est élevée à 50°C et le temps diminué à 30 minutes, comme indiqué dans (Haddad et al., 2007). Afin de détecter la présence d'ADNc de MP1 ou de spt6 (témoin négatif), une amplification par PCR semi-quantitative est réalisée sur la réaction de rétro-transcription en utilisant des amorces spécifiques de MP1 et spt6 (couples MP1T4/MPRT2 et spt6F/spt6R respectivement). La PCR semi-quantitative est réalisée sur 4µl de réaction de rétro-transcription avec 1 unité de Taq polymérase (Taq DNA polymerase recombinante, Fermentas). 50 cycles de PCR (30 secondes à 94°C ; 45 secondes à 52°C ; 45 secondes à 72°C) sont réalisés et un aliquot de 10µl de

réaction est prélevé à 30, 35, 40, 45 et 50 cycles. Ces aliquots sont ensuite déposés sur gel d’agarose 2%. Celui-ci est mis à migrer et coloré au BET en fin de migration.

Analyse de l’enrichissement en ARN. L’intensité de chaque bande est mesurée à l’aide du

logiciel ImageJ et l’intensité du bruit de fond est retirée. Le cas échéant, l’intensité de la bande correspondant à une contamination par l’ADN génomique est également soustraite. Le rapport entre les intensités obtenues après immunoprécipitation de la protéine d’intérêt par rapport à l’immunoprécipitation contrôle est réalisé pour chaque cycle. A partir de 35 cycles, le signal dépasse celui du bruit de fond et un enrichissement en MP1 dans l’immunoprécipitation du chromodomaine ou de la protéine Corto entière par rapport à l’immunoprécipitation contrôle est détecté. L’inverse est obtenu pour le contrôle spt6. Après 40 cycles, la réaction de PCR atteint un plateau et plus aucun enrichissement n’est mesurable.