Afin de déterminer si cette dérégulation de la voie BER au niveau de l’expression des gènes se retrouve aussi au niveau de l’activité enzymatique de réparation de l’ADN, nous avons utilisé la biopuce plasmide développée par la start-up LX-Repair. Ce test miniaturisé permet la quantification du potentiel d’excision-resynthèse notamment des petites lésions associées au BER. Le test implique la quantification de la réparation des plasmides déposés sur la biopuce et portant chacun une classe spécifique de dommage. Parmi les lésions, on retrouve les lésions 8-oxoG qui mettent en évidence la capacité de reconnaissance et d’excision de la glycosylase OGG1 (8-oxoguanine glycosylase) suivi de l’étape de resynthèse. Les lésions AlkB permettent de mettre en exergue la capacité d’excision de l’ADN glycosylase alkyladénine (AAG) et des étapes de resynthèse qui suivent. Enfin, les lésions thymine glycol permettent l’observation de la capacité de reconnaissance et d’excision de l’ADN glycosylase Thymine (TDG) suivi de l’étape de resynthèse.
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Figure 29 : Mesure de l’activité d’excision-resynthèse à l’aide de la biopuce
plasmide dans la lignée normale (GM00730) et les lignées Gorlin (GM01552, GM02098 et GM03300) à un niveau basal. 8oxoG correspond à la mise en évidence de la capacité de
reconnaissance et d’excision de la glycosylase OGG1suivi de l’étape de resynthèse. AlkB correspond à l’étude dela capacité d’excision de l’AAGet des étapes de resynthèse qui suivent. Enfin, Glycol correspond à l’étudede la capacité de reconnaissance et d’excision de la TDG suivi de l’étape de resynthèse. Le rapport a été effectué par rapport à la valeur de la lignée normale sans irradiation. Deux expériences indépendantes ont été réalisées (n = 2).
* : valeur significativement différente (p<0,05) de la lignée normale (GM00730) non irradié (Test de Student).
Figure 30 : Exemple de résultats obtenus sur biopuce plasmide. Chaque spot
correspond à une lésion particulière. Chaque lésion est présente en trois doses différentes, chacune en duplicat technique. L’incorporation de nucléotides fluorescents permet de quantifier l’activité d’excision-resynthèse de différentes glycosylases spécifiques.
On s’aperçoit que les spots sont plus fluorescents pour la lignée normale que pour la lignée GM01552, indiquant un phénotype réparation diminué dans cette dernière.
* * * * * * * 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
8oxoG AlkB Glycol
A ct iv it é d e r é p a ra ti o n GM00730 GM01552 GM02098 GM03300 GM01552 0Gy GM00730 0Gy
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1) Activité enzymatique de la voie BER au niveau
basal
Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’activité d’excision-resynthèse des fibroblastes Gorlin et de la lignée de fibroblastes normaux à un niveau basal (Figures 29 et 30). Il apparait que cette activité pour les lésions associées à la reconnaissance par la glycosylase OGG1 est statistiquement régulée à la baisse dans la lignée GM01552 (0,05 ± 0,03, p = 5,033E- 06), ainsi que dans la lignée GM03300 (0,17 ± 0,01, p = 7,339E-05) par rapport à la lignée
normale. A nouveau, ces deux lignées de fibroblastes Gorlin présentent une réduction de leurs activités d’excision-resynthèse des lésions associées à la reconnaissance par la protéine AAG : 0,18 ± 0,07, p = 0,0016 pour la lignée GM01552 et 0,35 ± 0,06, p = 0,0358 pour la lignée GM03300. La valeur obtenue pour la lignée GM02098 (0,69 ± 0,13, p = 0,0557) n’est pas statistiquement différente de celle observée pour la lignée GM00730. Enfin, concernant l’activité d’excision-resynthèse des lésions glycols, les trois lignées Gorlin présentent une diminution statistiquement différente (de 0,15 ± 0,07, p = 0,0015 pour la lignée GM01552 à 0,61 ± 0,13, p = 0,0329 pour la lignée GM02098) par rapport à la lignée normale.
2) Activité enzymatique de la voie BER après
exposition à une forte dose de rayonnement ionisant
Nous nous sommes ensuite intéressés à l’activité d’excision-resynthèse de ces lignées cellulaires 24 h après une dose d’irradiation de 6 Gy (Figure 31). Cette dose a été choisie afin de modéliser l’impact d’une forte dose d’irradiation sur les fibroblastes Gorlin.
Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rapport lignée irradiée/lignée normale irradiée afin d’étudier la réponse de l’activité d’excision-resynthèse. La réparation de la lésion 8-oxoG a été considérablement réduite dans la lignée cellulaire GM01552 (0,05 ± 0,05, p = 0,0097) par rapport à la lignée cellulaire GM00730 après une forte dose d’irradiation. Aucune différence statistique n'a été observée pour les deux autres lignées cellulaires Gorlin (0,50 ± 0,12, p = 0,54 pour GM02098 et 0,29 ± 0,17, p = 0,20 pour GM03300). En ce qui concerne l'activité d’excision-resynthèse associées aux lésions AlkB, elle est réduite dans la lignée cellulaire GM01552 (0,15 ± 0,09, p = 0,0139) par rapport à la lignée cellulaire GM00730 après une irradiation à 6 Gy. Une nouvelle fois, aucune différence n'a été mise en évidence pour les deux autres lignées cellulaires Gorlin (0,63 ± 0,10, p = 0,72
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Figure 31 : Mesure de la réponse de l’excision-resynthèse à l’aide de la biopuce
plasmide dans la lignée normale (GM00730) et les lignées Gorlin (GM01552, GM02098 et GM03300) 24h après une irradiation de 6 Gy. 8oxoG correspond à la mise en évidence
de la capacité de reconnaissance et d’excision de la glycosylase OGG1suivi de l’étape de resynthèse. AlkB correspond à l’étude dela capacité d’excision de l’AAGet des étapes de resynthèse qui suivent. Enfin, Glycol correspond à l’étudede la capacité de reconnaissance et d’excision de la TDG suivi de l’étape de resynthèse. Le rapport a été effectué par rapport à la valeur de la lignée normale non irradiée. Trois expériences indépendantes ont été réalisées (n = 3).
* : valeur significativement différente (p<0,05) de la lignée normale (GM00730) irradiée à la même dose (6 Gy) (Test de Student).
* * * 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
8oxoG AlkB Glycol
R a p p o rt d 'a ct iv it é i rr a d ié /n o n i rr a d ié GM00730 GM01552 GM02098 GM03300
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pour GM02098 et 0,41 ± 0,10, p = 0,17 pour GM03300). Il semble que GM02098 (0,56 ± 0,08, p = 0,46) et GM03300 (0,36 ± 0,09, p = 0,15) possèdent une capacité de reconnaissance et d’excision de la TDG suivi de l’étape de reconnaissance comparable à celle de la lignée normale après une forte dose d’irradiation. En revanche, l’activité de réparation des lésions glycol est statistiquement diminuée dans la lignée GM01552 (0,11 ± 0,06, p = 0,0085) par rapport à la lignée cellulaire normale après exposition aux rayonnements γ.
Dans un second temps, nous nous sommes intéressés au rapport lignée irradié/même lignée non irradiée afin d’étudier la stimulation. Aucune différence significative n’a été trouvée entre les valeurs de chaque lignée Gorlin au niveau basal et après une forte dose de rayonnement ionisant. En revanche, la lignée normale présente une forte diminution de l’activité d’excision- resynthèse de ces trois dommages après une irradiation γ.