B Evaluation de la survie clonale à long terme après exposition à différents stress
4) Effet de la bléomycine
Enfin, nous nous sommes intéressés à la réponse des fibroblastes Gorlin et des fibroblastes normaux à des doses croissantes de bléomycine (Figure 24-B). Bien que le mécanisme ne soit pas totalement résolu, ce radiomimétique permet la création de cassures double brin pur
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permettant la mobilisation des voies de réparation de ces lésions : NHEJ ou HR, en fonction de la phase du cycle cellulaire.
Aucune différence significative n’a été retrouvée entre la lignée de fibroblastes primaires normaux et les trois lignées de fibroblastes primaires issues de patients atteints du syndrome de Gorlin. En effet, les expériences que nous avons mené montrent un IC50 de 0,243 µM pour la
lignée GM00730, 0,285 µM pour la lignée GM01552, 0,297 µM pour la lignée GM02098 et 0,263 µM pour la lignée GM03300.
C - Conclusion
Le premier pan de ce chapitre sur la validation des fibroblastes Gorlin en tant que modèle de la NBCCS nous a mené à tester le statut de l’expression génique de certains des acteurs de la voie de signalisation SHH dans ces cellules. Comme nous pouvions nous y attendre au vu des résultats obtenus par nos collaborateurs montrant une mutation du gène PTCH1 dans les lignées primaires Gorlin, l’expression de l’ARN messager de ce récepteur transmembranaire est significativement diminuée dans les cellules Gorlin. Cette diminution a donc probablement un impact au niveau de l’activation de la voie. Les anticorps permettant une reconnaissance de la protéine PTCH1 existent mais sont cependant peu fiables, nous n’avons donc pas pu vérifier ces résultats au niveau protéique.
Toutefois, nous avons testé l’expression génomique de GLI2 et de la cycline D1, deux autres acteurs de la voie sonic hedgehog. Aucune différence d’expression n’est retrouvé en ce qui concerne le transcrit de GLI2. Cela peut s’expliquer par la présence d’autres facteurs de transcription GLI, GLI1 et GLI3, qui sont peut être eux différentiellement régulés chez ces patients. En revanche, la dérégulation de la voie sonic hedgehog entraînée par la mutation présente sur le gène PTCH1 mène à une augmentation significative de la production des ARN messagers de la cycline D1. Cette cycline joue un rôle très important au niveau du cycle cellulaire et notamment au niveau du passage de la phase G1 à S. Or, nos collaborateurs ayant travaillé plus finement sur les possibles dérégulations du cycle cellulaire présentes au niveau de ces fibroblastes Gorlin démontrent plutôt une modulation au niveau du passage de la phase G2 à M. Toutefois, cette dérégulation de l’expression de la cycline D1 démontre bien une dérégulation de l’activation de la voie SHH.
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Dans un second temps, nous avons cherché à caractériser la réponse des fibroblastes Gorlin et normaux à différents stress induisant differents types de lésions au niveau de l’ADN : rayonnement ionisant, UVB, UVA et bléomycine. Les patients atteints du syndrome de Gorlin étant hyper-radiosensibles, nous avons donc décidé dans un premier temps, de tester la réponse des fibroblastes aux RI afin de savoir si ils étaient capables de reproduire le même phénotype in vitro. Le test de survie clonogénique à long terme nous a permis de mettre en évidence une forte sensibilité aux rayonnements ionisants des fibroblastes Gorlin par rapport aux fibroblastes normaux. Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus par Chan et al. (174) qui ont démontré cette hyper-radiosensibilité des fibroblastes Gorlin. Cependant, Featherstone et al. (173) n’ont pas réussi à retrouver ces conclusions. Ces résultats contradictoires peuvent s’expliquer par des différences méthodologiques ou plus probablement par les différences individuelles observées entre les fibroblastes provenant de plusieurs patients atteints par le syndrome de Gorlin. En effet, nos résultats démontrent l’importance de la position de la mutation au niveau du gène PTCH1 dans la radiosensibilité. Plus la mutation apparait au début du géne, plus la cellule sera hyper-radiosensible. Ainsi, la lignée GM01552 est donc la lignée la plus hyper-radiosensible avec laquelle nous travaillons. Nos collaborateurs (Equipe M. MARTIN et Equipe J. LAMARTINE) ont décrit le même phnomène (Publication à paraître). Nous avons vu lors de l’étude bibliographique que les rayonnements ionisants entraînaient l’apparition de cassures double brin et de lésions oxydatives. Ces dernières sont prises en charge par les voies de réparation NHEJ et HR (pour les cassures double brin) et BER (pour les lésions oxydatives).
De nombreuses études se sont intéréssées au statut photosensible des lignées issues de patients atteints du syndrome de Gorlin. Par conséquent nous avons décidé d’examiner la réponse des cellules que nous étudions. D’un point de vue global, les tests statistiques n’ont pas permis de mettre en évidence une sensibilité des lignées Gorlin aux UVB par rapport à la lignée normale. Certaines études et notamment celle de Brellier et al. (179) ont mis en évidence le même résultat. En revanche, Applegate et al. (177) ont décrit une hypersensibilité des fibroblastes Gorlin à ce stress générateur de photo-produits et de dimères de pyrimidines. Toutefois, ils mentionnent dans leur publication la possibilité que leur lampe UVB puisse aussi émettre dans les longueurs d’ondes correspondant aux UVA. Nous avons donc testé la réponse des fibroblastes de notre étude au regard des UVA et avons réussi à démontrer leurs sensibilités. Les UVA sont connus pour générer des dommages oxydatifs, ainsi que des dimères de pyrimidines (17, 20). Ils entraîneront donc préférentiellement la mobilisation des voie de réparation BER et NER, tandis que les dommages crées par les UVB mèneront plutôt à celle de
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la voie NER. Or, ces derniers n’entraînent pas de sensibilités au niveau des fibroblastes Gorlin par rapport aux fibroblastes normaux.
Lors de cette étude, nous n’avons pas testé les rayonnements UVC pourtant habituellement étudiés. En effet, ceux-ci étant stoppés par l’atmosphère, ils n’atteignent pas la surface terrestre et ne jouent donc pas de rôle au niveau du phénotype des patients Gorlin.
Après les différents stress physiques, nous avons testé un dernier stress chimique : la bléomycine. Après une exposition des cellules à des doses croissantes de ce générateur de cassures double brin purs, aucune différence significative dans la survie cellulaire à long terme n’a pu être observée entre les trois lignées Gorlin et la lignée normale. Ce radiomimétique entraîne la mobilisation des voies de réparation des cassures double brin de l’ADN.
Finalement, cette étude de survie clonogénique à long terme nous permet d’observer une sensibilité des fibroblastes issus de patients atteints du syndrome de Gorlin aux agents induisant des lésions oxydatives (RI et UVA) prises en charge par la voie BER. Elle démontre que la mutation présente au niveau du gène PTCH1 dans les fibroblastes atteints du syndrome de Gorlin entraîne une augmentation de la radiosensibilité de ces derniers et que cette augmentation est directement corrélable avec la position de la mutation. Plus la protéine sera tronquée, plus la cellule sera hyper-radiosensible.
Ainsi, ces résultats démontrent que les fibroblastes Gorlin utilisés lors de cette étude représentent un bon modèle cellulaire pour la modélisation du syndrome de Gorlin.
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