Effet de différentes doses de rayonnements ionisants

Dans un second temps, nous avons analysé la production de cet anion superoxyde, après un stress aux rayonnements γ de plusieurs doses : 0,1 Gy, considéré comme une faible dose d’irradiation ; 2 Gy, la dose standard d’irradiation en radiothérapie et 6 Gy, utilisé en tant que forte dose d’irradiation (Figure 34).

L’anion superoxyde est donc significativement plus produit dans la lignée GM01552 par rapport à la lignée normale après un stress aux rayonnements ionisants et ceux dès la plus faible doses d’irradiations (5,26 ± 0,49, p = 0,0207 à 0,1 Gy ; 8,35 ± 1,68, p = 0,0043 à 2 Gy et 5,10 ± 0,35, p =0,0349 à 6 Gy). Les résultats obtenus pour la lignée GM03300 montrent une tendance similaire. Toutefois, la production est significativement augmentée uniquement à partir d’une irradiation de 2 Gy (2,03 ± 0,45, p = 0,0389 à 2 Gy et 2,19 ± 0,72, p = 0,0426 à 6 Gy). En revanche, la lignée GM02098 semble posséder la même habilité à produire l’anion superoxyde que la lignée GM00730 après un stress aux RI (p= 0,1739 pour 0,1Gy ; p = 0,5655 pour 2 Gy et p = 0,2873 pour 6 Gy).

Nous nous sommes ensuite intéréssés au rapport lignée irradiée/même lignée non irradiée afin de tester l’effet de l’irradiation sur la production de ce ROS. Seule la lignée GM01552 présente un effet significatif de l’irradiation (p= 0,0036 pour 0,1Gy ; p = 0,0072 pour 2 Gy et p = 0,0030 pour 6 Gy).

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Figure 34 : Mesure de la production de l’anion superoxyde par FACS dans la

lignée normale (GM00730) et les lignées Gorlin (GM01552, GM02098 et GM03300) 25 minutes après un rayonnement γ de 0,1 Gy, 2 Gy ou 6Gy. Aucune différence statistique

n’a pu être mise en évidence entre la lignée GM00730 et la lignée GM02098 pour la production de ce ROS. En revanche, la lignée GM01552, ainsi que la lignée GM03300 possède un fort accroissement de cette production après un stress aux RI. Le rapport a été effectué par rapport à la valeur de la lignée normale non irradiée. Trois expériences indépendantes ont été réalisées (n = 3).

* : valeur significativement différente (p<0,05) de la lignée normale (GM00730) irradiée à la même dose (Test de Student).

* * * * * 0 2 4 6 8 10 12 0,1 Gy 2 Gy 6 Gy R a p p o rt d e p ro d u ct io n ir ra d ié /n o n i rr a d ié GM00730 GM01552 GM02098 GM03300

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D - Conclusion

Afin de déterminer si la sensibilité des fibroblastes issus de patients atteints du syndrome de Gorlin aux rayonnements ionisants et aux UVA est due à un défaut de réparation de l’ADN induit par ces agents génotoxiques, nous avons décidé d’évaluer l’expression des ARN messagers du BER des quatre lignées primaires de notre étude au niveau basal et après différentes doses d’irradiations. Cette étude s’est poursuivie par une étude de l’activité d’excision-resynthèse à l’aide d’une biopuce développé par la start-up LX repair. Enfin, afin de vérifier nos hypothèses, nous avons étudié la production de l’un des ROS les plus produits au niveau cellulaire : l’anion superoxyde.

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’impact de la mutation PTCH1 sur la voie de réparation par excision de bases. Une sous expression globale de la plupart des gènes du BER est retrouvée. On peut noter un effondrement particulièrement marquant au niveau de l’étape de reconnaissance de ces lésions par les glycosylases au niveau basal. En effet, les deux glycosylases impliquées dans la réparation des lésions 8-oxoguanine, OGG1 et MYH, sont toutes les deux significativement réduites. Des études ont démontré qu’une faible expression d’OGG1 pouvait entraîner une accumulation d’espèce réactive de l’oxygène (ROS) menant à l’augmentation des lésions 8-oxoG (201, 202). Il en va de même pour la glycosylase UNG et l’endonucléase APE1, toutes les deux impliquées dans la radiosensibilité (203, 204). Sobol et al. (205) démontrent dans leur étude qu’une délétion de la polymérase β peut mener à des défauts de réparation par excision de bases et une hypersensibilité aux agents alkylants. Nos expériences de PCR en temps réel n’ont pas réussi à mettre en évidence la modulation de l’expression de ce gène à un niveau basal. Enfin, l’expression du gène codant pour XRCC1 est elle aussi significativement diminuée dans les cellules Gorlin. Il est intéressant de noter que ce gène a lui aussi été décrit comme jouant un rôle dans la radiosensibilité des lignées cellulaires (206). En revanche, le lien entre l’expression de la ligase 3 et la radiosensibilité a été très peu étudié. Toutefois, deux lignées Gorlin sur les trois étudiées présentent une diminution de l’expression de cette ligase.

Suite à ces études d’expression génique, nous avons décidé de vérifier si cette dérégulation était aussi retrouvée au niveau de l’activité enzymatique. Afin de répondre à cette question, nous avons utilisé la biopuce plasmide développée par la start-up LX repair. Ce test miniaturisé permet d’étudier notamment l’activité d’excision-resynthèse de la voie de réparation BER. Nos résultats démontrent une diminution globale de cette activité dans les cellules Gorlin par rapport

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aux cellules normales sans irradiation. Au niveau basal, les activités AAG et TDG sont réduites. En ce qui concerne la réparation des lésions 8-oxoG, deux des trois lignées primaires Gorlin étudiées présentent une diminution de cette activité d’excision-resynthèse. Ces résultats peuvent être corrélés avec la diminution globale de l’expression des gènes MYH et OGG1. Enfin, les études à l’aide du MitoSOXTM _{n’ont pas mis en évidence de différence de production}

de l’anion superoxyde entre la lignée normale et les trois lignées Gorlin étudiées à un niveau basal. Cette espèce réactive de l’oxygène, précurseurs des autres ROS, mène notamment à l’apparition de lésions 8-oxoG.

Toutes ces données assemblées mènent à la conclusion d’une déficience de la voie BER dans les fibroblastes issus de patients atteints du syndrome de Gorlin. Les cellules de ces patients sont donc moins équipées pour faire face aux dommages oxydatifs induits par le métabolisme cellulaire de base ou par des agents exogènes générateurs de stress oxydant.

Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’effet de l’irradiation sur la stimulation de la voie BER. Globalement, on retrouve le même effondrement de l’expression des gènes de glycosylases UNG, MYH, OGG1 et APE1 après les différentes doses de rayonnements ionisants testées. Toutefois, l’impact de l’irradiation semble être plus fort au niveau des cellules normales que des cellules Gorlin. De plus, il semble que l’expression de la polymérase β ne soit pas impactée par les doses faibles et fortes d’irradiations que ce soit dans les cellules Gorlin ou les cellules normales. Ce gène semble toutefois être sous-régulé après une irradiation de 2 Gy. En ce qui concerne les gènes XRCC1 et Lig3, ils sont globalement tous les deux sous-régulés après une exposition au rayonnement ionisant et ceux dès une dose considérée comme faible.

L’étude des activés d’excision-resynthèse après une forte dose d’irradiation nous apprend que l’effet de l’irradiation impacte fortement la lignée normale, GM00730 mais pas les lignées Gorlin. Il est à noter qu’une nouvelle fois la lignée GM01552 présente une très faible activité d’excision-resynthèse des lésions associées au BER.

Enfin, on retrouve un accroissement de la production de l’anion superoxyde dans deux des trois lignées Gorlin après une exposition aux rayonnements ionisants après une dose standard et une forte dose d’irradiation. Il est intéressant de remarquer que la lignée GM01552 présente une augmentation significative de la production de ce ROS après exposition aux RI.

Il est important de noter ici que l’effet de l’irradiation semble être plus faible que l’impact de la mutation au niveau basal.

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Finalement, à la lumière des résultats de cette partie, nous pouvons penser que l’augmentation de la production de l’anion superoxyde conduira à l’augmentation des dommages de l’ADN. Couplé au défaut de la voie de réparation par excision de bases au niveau basal, ces résultats pourraient expliquer la prédisposition aux cancers des patients atteints du syndrome de Gorlin. Cette hypothèse sera approfondie dans la partie Discussions.

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Figure 35 : Les voies de réparation des cassures double brin et leurs principaux

acteurs : à gauche, la voie de recombinaison homologue (HR) et à droite, la voie de réparation par suture non homologue (NHEJ). Cette première voie nécessite la

reconnaissance de la lésion par le complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1). Suite à la création d’une longue extrémité simple brin protégée par RPA, la protéine RAD51 sera recrutée afin de rechercher la séquence homologue au niveau de la chromatide sœur. Il y aura alors formation d’une jonction Holliday autorisant l’action d’une ADN polymérase puis de l’ADN ligase I afin d’obtenir un néobrin d’ADN exempt de lésion. En ce qui concerne la voie NHEJ, les extrémités libres vont être reconnues par le complexe Ku70-Ku80. Ce dernier va permettre le recrutement de la DNA-PKCs qui en s’autophosphorylant va induire un changement conformationel laissant libre les extrémités pour les protéines nécessaires à la gestion de la cassure. Enfin, la ligase IV et le facteur XRCC4 seront recrutés afin de mener à bien la ligature des deux brins.

Les principaux acteurs de ces voies testés au regard de leur expression génique sont entourés en rouge.

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