2 - Evaluation de l’organisation supramoléculaire du protéome soluble de la vacuole

Après la purification des vacuoles, les organites ont fait l’objet d’une lyse par congélation / décongélation, suivie d’une étape de centrifugation à haute vitesse afin de séparer les fractions solubles et membranaires (Figure 28). La fraction soluble a alors pu être concentrée par

Vacuoles Lyse + Lavage NaCl Ultracentrifugation Membranes lavées Soluble + « associé » Analyse globale SDS-PAGE Anal. en solution Membranes + « associé » Soluble Purification des vacuoles

Stratégie d’analyse protéomique de la vacuole

Lyse

2D IEF / SDS-PAGE

Cartographie 2D Analyse de l’organisation supramoléculaire

2D BN / SDS-PAGE

Identification des protéines par spectrométrie de masse (LC-MS/MS) – Coll. LEDyP, CEA-Grenbole

Figure 29 : Stratégie d’analyse de l’organisation supramoléculaire du protéome de la vacuole d’Arabidopsis

thaliana. Des vacuoles ont été purifiées, puis lysées par congélation / décongélation. Les fractions membranaires et solubles ont été séparées par centrifugation, et chacune a fait l’objet d’une électrophorèse en conditions non dénaturantes dans une première dimension, puis en présence de SDS dans une seconde dimension.

Chapitre II : Aspects quantitatifs et organisationels du protéome vacuolaire

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ultrafiltration (système Vivaspin, « cut off » de la membrane = 3 kDa), pour atteindre une concentration finale de 1 µg / mL de protéines. Environ 100 µg de ces échantillons protéiques ont alors été déposés au sommet d’un gel de gradient d’acrylamide, et une électrophorèse en conditions non dénaturantes, en présence de bleu de Coomassie, a permis de séparer les complexes d’une taille variant entre 50 et 1000 kDa. La Figure 30 présente un gel d’électrophorèse de type BN-PAGE, et trois gels de type BN / SDS-PAGE, illustrant l’évolution de la résolution au fur et à mesure de la mise en place du protocole. La comparaison de ces électrophorèses montre que, si la résolution est variable d’une expérience à l’autre, le profil protéique reste quant à lui constant, la plupart des spots étant présents sur l’ensemble des gels réalisés. Cette méthode nous a permis de mettre en évidence un certain nombre de complexes putatifs, probablement impliqués dans des fonctions vacuolaires majeures.

La Figure 30–A présente le profil électrophorétique en conditions non dénaturantes de la fraction soluble de la vacuole, fixé dans un bain éthanol / acide acétique et recoloré au bleu de Coomassie R250. Ce profil fait apparaître clairement une série de bandes, de masses moléculaires allant jusqu’à environ 800 kDa, qui correspondent à des associations protéiques et dont certaines ont pu être analysées par spectrométrie de masse. Parmi celles-ci, quatre, d’une taille supérieure à 500 kDa, sont composés des mêmes protéines, leur présence sous forme de multiples bandes étant très probablement due à un degré d’oligomérisation différent d’un complexe à l’autre. Ces complexes potentiels sont particulièrement intéressants, car ils semblent associer des protéines de type différents : protéases (subtilases et protéines à domaine « Meprin & TRAF » notamment), glycosidases (RGP1), et inhibiteurs de glycosidases (PGIP1 et PGIP2). La présence de ces protéines au sein d’un même complexe est bien entendu à confirmer par des analyses plus ciblées, mais l’identification systématique de ces protéines dans des bandes nettes de la première dimension rend peu probable la présence de plusieurs complexes indépendants.

Deux autres bandes, d’environ 250 et 500 kDa, contiennent deux isoformes de l’α -mannosidase (AT3G26720 et AT5G13980). Connue pour s’associer en multimères (Hutchins & Klionsky, 2001) chez Saccharomyces cerevisiae, ces complexes putatifs sont très probablement les formes dimérique et tétramérique de l’enzyme et nous confirmons ici sa structure oligomérique chez la plante. Toutefois, la séparation des protéines en conditions dénaturantes, dans une seconde dimension, permet d’observer un spot majeur de 250 kDa correspondant aux deux α-mannosidases (Figure 30, complexe I), et il apparaît alors que cette protéine se répartit en réalité sur une large échelle de masses après la première dimension (250 à 500 kDa), ce qui pourrait suggérer que ce complexe, en grande quantité dans le protéome soluble, soit relativement labile et se dissocie lors de la préparation des échantillons. La forme dimérique (homo ou hétérodimère), de 250 kDa, serait par contre très stable puisqu’elle résiste à la dénaturation en présence de SDS. Mais nous ne pouvons pas exclure que plusieurs associations protéiques comprenant le dimère d’α-mannosidase

Chapitre II : Aspects quantitatifs et organisationels du protéome vacuolaire - 131 - 250 150 100 75 50 37 25 20 (kDa) 250 150 100 75 50 37 25 20 (kDa) 250 150 100 75 50 37 25 20 (kDa) 250 150 100 75 50 37 25 20 (kDa) Subtilase TPPII (AT4G20850)

PGIP1 (AT5G06860) PGIP2 (AT5G06870) Protéine à domaine « Meprin and TRAF » (AT5G26780) « cucumisin-like » (AT5G67360) Carboxypeptidase à serine (AT3G10450) RGP1 (AT3G02230)

β-hexosaminidase (AT3G55260)

α-mannosidase (AT3G26720)

α-mannosidase (AT5G13980)

Protéine similaire à TolB (AT4G01870)

α-fucosidase (AT2G28100) Phosphodiesterase de type I (AT4G29680) Peroxidase 17 (AT2G22420) Gamma-glutamyltranspeptidase (AT1G78870) PLAT/LH2 (AT4G39780) 66 232 440 669 140 (kDa) 66 232 440 669 140 (kDa) α-mannosidase (AT3G26720) α-mannosidase (AT5G13980) (A) (C) (B) (D) α-mannosidase (AT3G26720)

α-mannosidase (AT5G13980) ^{Peroxydase (AT3G49120)}

Curculin-like (AT1G78850)

Peptidase à sérine (AT3G10450) Subtilase (AT3G14067)

α-glucosidase (AT5G11720) Hexosaminidase (AT3G55260)

α-fucosidase (AT2G28100)

Aspartyl aminopeptidase (AT2G24200)

Cucumisin-like (AT3G14067)

RD21 (AT1G47128)

α-galactosidase (AT3G56310) Estérase / lipase (AT4G16690)

Peroxydase (AT3G49120)

Pectine methylestérase (AT4G29680)

I I I I II ^II II II III III ^III III IV IV IV IV V V V (E) 1èredimension

Figure 30 : Mise en évidence des complexes majeurs du protéome soluble par BN-PAGE et BN / SDS-PAGE.

(A) : Les échantillons (100 µg) ont fait l’objet, dans un premier temps, d’une électrophorèse en conditions non-dénaturantes sur gradient d’acrylamide (5 % - 13 %). Les complexes protéiques de l’échantillon, préservés, se séparent et il est alors possible d’analyser le contenu protéique des « bandes » obtenues lors de la première dimension. (B à D) : Alternativement, la piste de migration a pu être placée au sommet d’un gel de type SDS-PAGE afin de dissocier les protéines impliquées dans les complexes séparés lors de la première dimension, révélée ensuite par coloration à l’argent. Il est alors quelques fois possible de reconstituer de visu les complexes initiaux. (E) : spots qui ont pu être identifiés.

Chapitre II : Aspects quantitatifs et organisationels du protéome vacuolaire

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soient également possibles, composant ainsi un ensemble de différents complexes qui se répartiraient selon les masses moléculaires comprises entre 250 à 500 kDa. Ceux-ci seraient alors composés d’un (ou plusieurs) « noyau(x) » constitué(s) de 2 α-mannosidases, sur le(s)quel(s) viendraient éventuellement s’ajouter diverses protéines. En effet, l’hypothèse d’un tel complexe, modulaire, est notamment soutenue par l’identification systématique, dans la première dimension, des 2 isoformes de l’α-mannosidase dans les mêmes bandes, éventuellement accompagnées d’autres glycosidases, suggérant là encore une association des α-mannosidases entre elles, et parfois avec d’autres hydrolases. Une hexosaminidase (AT3G55260), en particulier, est détectée avec les 2 α -mannosidases dans l’une des bandes de la première dimension, et retrouvée dans la seconde dimension sous formes de deux spots.

D’autres complexes, probablement plus minoritaires, pourraient également faire intervenir des glycosidases. On retrouve notamment une association potentielle entre une α-glucosidase (famille 5, AT5G11720) et une protéine de type lectine (curculin-like, AT1G78850) (Figure 30, complexe II). Les lectines sont capables de lier certains sucres, et l’association d’une telle protéine avec une glycosidase pourrait former un complexe protéique dont une sous-unité (la lectine) lierait le substrat, tandis que l’autre (la glucosidase) l’hydrolyserait. Enfin, une α-fucosidase (glycosidase de la famille 29), est également identifiée dans un spot de la seconde dimension (Figure 30, complexe III). La migration de cette protéine lors de l’électrophorèse en conditions non-dénaturantes semble correspondre à celle d’une protéine d’environ 200 kDa. D’une taille de 57 kDa (cohérente avec la valeur estimée à partir de la seconde migration), elle serait présente sous forme trimérique ou tétramérique dans la vacuole, aucune protéine n’étant identifiée sur la même ligne de migration dans la seconde dimension.

Certaines protéases du protéome soluble (ou associées à la membrane) de la vacuole semblent également être présentes sous forme multimérique. Une aspartyl aminopeptidase (AT5G60160), par exemple, est identifiée dans la première dimension à une masse moléculaire d’environ 440 kDa (Figure 30, complexe IV). Cette protéine de 52 kDa est connue pour former des complexes protéiques, et il semble qu’elle soit effectivement associée sous forme d’octamères dans nos échantillons. Mais de façon très intéressante, cette protéine est, dans la seconde dimension, présente dans 2 spots, où elle est identifiée seule. Ces spots correspondent à des protéines d’environ 30 et 22 kDa, ce qui suggère un clivage de la protéine de 52 kDa en 2 peptides, associés en un oligomère (16mère) comparable à l’octamère de la protéine non clivée. Décrite comme étant cytosolique, elle est présente dans les deux cartographies des protéomes solubles cytosolique et vacuolaire. Si sa taille dans le cytosol est effectivement d’environ 52 kDa (Figure 25), la cartographie du protéome vacuolaire confirme sa présence sous une forme, tronquée, d’environ 30 kDa (Figure 23, la protéine de 22 kDa n’ayant pas été identifiée sur ce gel). La présence de cette métalloprotéase dans le protéome soluble vacuolaire n’est donc probablement pas due à sa

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dégradation, tel que cela avait été suggéré à l’issu de la comparaison des cartographies, mais plus probablement à son association avec le tonoplaste, ou éventuellement à sa localisation à l’intérieur de la vacuole, les expériences de « Shave & Conquer » ne permettant pas de trancher (données non montrées). Cette forme « vacuolaire » différerait de la forme cytosolique par une maturation via un clivage de la protéine, les deux fragments restant liés l’un à l’autre, à l’intérieur de complexes de type 16mère. Un autre complexe potentiel (Figure 30, complexe V) faisant intervenir des protéases est constitué d’une subtilase (AT3G14067) et d’une peptidase à serine (AT3G10450).

Ces analyses préliminaires ont permis d’évaluer l’organisation supramoléculaire du protéome soluble de la vacuole et ont abouti à la mise en évidence de quelques complexes putatifs. Ceux-ci semblent souvent associer différentes protéines d’une même famille (glycosidases ou protéases), suggérant que des complexes enzymatiques à la fois relativement spécialisés (protéolytique ou glycolytique) et multipotentiels (plusieurs enzymes aux substrats différents) puissent assurer une partie des activités hydrolytiques connues de la vacuole. Toutefois un complexe majeur, dont le nombre de sous unité semble variable, pourrait rassembler différentes activités de protéolyse (Subtilase, protéine à domaine Meprin & TRAF) et de glycolyse (RGP1) au sein d’un même structure protéique.

III.3 - Evaluation de l’organisation supramoléculaire du protéome