Etudes sur la formation du biofilm

4.2.2.1. Etude de la formation du biofilm par la méthode in vitro de «Biofilm Ring Test^®»

La méthode du BFRT^®décrite par Chavant et al. (2007) permet de suivre de façon simple et rapide l’immobilisation de billes magnétiques par les cellules bactériennes adhérant au fond du puits. Plus les billes seront piégées, moins elles se déplaceront dans le champ magnétique et moins elles se regrouperont au centre du puits. L’immobilisation des billes est secondaire soit au fait qu’elles sont «piégées» par des bactéries qui adhèrent au fond du puits, soit au fait que les propriétés rhéologiques du milieu sont modifiées.

D’une façon expérimentale, les souches de SASM et SARM ont été cultivées en milieu BHI et incubées toute la nuit à 35°C sous agitation orbitale à 150 tours/min afin d’obtenir une culture bactérienne en phase stationnaire. Cette culture a été ajustée à une D.O.600 nm de 1,00 ± 0,05 et diluée au 1/250^ème dans du BHI stérile pour obtenir une suspension bactérienne initiale (SBI) contenant environ 10⁷ UFC/mL. Cette SBI a été mélangée avec un volume adéquat d’une solution de toner (billes magnétiques) puis placée dans les puits de la microplaque. Chaque condition était étudiée en triplicat. Deux puits de la barrette ont servi de puits contrôle. Après chaque temps d’incubation à 35°C en atmosphère humide (0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h), tous les puits ont été couverts avec quelques gouttes du liquide de contraste et scannés avec un lecteur de microplaques pour avoir une image I_o. La microplaque a été ensuite placée pendant 1 min sur un aimant (Block Test) et scannée de nouveau pour avoir une image I₁. La capacité d’adhésion de chaque souche était exprimée par un indice de formation du biofilm (BFI) calculé par le logiciel BFC elements^® et était basée sur la comparaison de ces deux images. Lorsque le BFI était ≥ 7, un spot correspondant aux microbilles attirées par l’aimant était visible et indiquait l’absence d’adhésion ou de biofilm (1). Lorsque le BFI était ≤ 2, il y avait absence de spot après magnétisation, signifiant ainsi le blocage des billes(2). Un biofilm en formation se traduisait par une immobilisation partielle de billes (2 ≤ BFI ≤ 7) (3) (Figure 4.2).

64

Figure 4.2: Critères d’interprétation du BFRT®

(1) (2) (3)

D’après (Badel et al., 2008)

4.2.2.2. Etude de la formation de biofilm par la méthode in vitro de coloration au cristal violet (CV)

Cette méthode est adaptée des techniques décrites par Stepanovic et al. (2000) et par Chavant et al. (2007). La méthode de coloration au CV est basée sur une mesure colorimétrique du cristal violet incorporé à la fois par les cellules attachées sur les puits et par la matrice organique formant le biofilm (Djordjevic et al., 2002). Toutes les souches étudiées avec le BFRT^® ont été également testées par la méthode de coloration au cristal violet. Pour chaque souche de S. aureus étudiée, 200 µL d’une SBI calibrée (10⁷ UFC/mL), préparée dans du milieu BHI, ont été placés dans les puits d’une microplaque. Les plaques ont été incubées dans des conditions similaires à celles du BFRT^®. Le milieu BHI stérile a servi de contrôle. Après chaque temps d’incubation, le milieu de culture a été éliminé et les puits ont été rincés 3 fois avec 200 µL d’eau distillée stérile pour éliminer les cellules non adhérées, puis séchés pendant 45 min sous la hotte. Ensuite, 100 µL de cristal violet (CV) ont été ajoutés dans les puits. Après 45 min, l’excès du cristal violet a été éliminé par 5 lavages successifs des puits avec 300 µL d’eau distillée stérile. Le colorant incorporé par les cellules ayant adhéré ou ayant formé un biofilm et par la matrice organique a été solubilisé avec 200 µL d’acide acétique glacial 33% (v/v). L’absorbance a été mesurée à 540 nm avec un lecteur de microplaques (Synergy HT, BioTek, Winooski, VT, Etats-Unis d’Amérique) et corrigée par l’absorbance des puits contrôles.

65

4.2.2.3. Exploration de la composition de la matrice du biofilm de SASM et de SARM

par BFRT^® et CV: Effet de la protéinase K et du periodate de sodium sur la formation

et la déstructuration du biofilm

4.2.2.3.1. Effet du periodate de sodium (PI)

Les monosaccharides et les polysaccharides sont très sensibles à l’oxydation par le PI. L’activité du PI sur l’adhésion et la formation de biofilms par les souches SASM et SARM a été évaluée en triplicat par la méthode de BFRT^® et par celle de coloration au CV comme décrit ci-haut.

4.2.2.3.1.1. La méthode du BFRT^®

Les puits ont été ensemencés par les cellules bactériennes au contact de billes magnétisables. Les bactéries ont été incubées pendant 4 h (temps correspondant au blocage significatif, complet ou partiel, des billes) soit en présence de 50 mM de tampon acétate de sodium (pH 4,5), soit en présence du même tampon plus du PI (10 mM concentration finale dans les puits). Si des polysaccharides contribuent à la structure du biofilm, leur oxydation par le PI affecte l’intégrité du biofilm et les particules magnétisables restent libres. On observe donc l’apparition du spot après magnétisation.

4.2.2.3.1.2. La méthode de coloration au CV 4.2.2.3.1.2.1. Test en préventif

L’efficacité du PI à prévenir la formation d’un biofilm a été mesurée pendant une incubation de 4 h sur les biofilms de SASM et SARM en formation. Pour ce faire, 180 µL de SBI ont été mis en contact soit avec du tampon acétate de sodium/BHI, soit avec du même tampon/BHI plus du PI (10 mM concentration finale dans les puits). Après l’incubation, les puits ont été soigneusement rincés, séchés et colorés au CV suivant la technique standard de coloration au CV. La densité optique a été lue à 540 nm comme indiqué ci-haut. L’inhibition (prévention) de la formation du biofilm par le PI suite à l’oxydation des polysaccharides se traduit par une diminution de la densité optique.

66

4.2.2.3.1.2.2. Test en curatif

La capacité du PI à déstructurer un biofilm préformé a été évaluée sur des biofilms formés pendant 24 h. Après ce délai, le milieu de culture a été soigneusement retiré et les puits ont été lavés 3 fois avec 200 µL d’eau distillée stérile avant incubation pendant 2 h des puits contrôles avec 200 µL de BHI-tampon acétate de sodium ou avec 200 µL de 10 mM (concentration finale dans les puits) de PI dans du milieu BHI pour les puits essais. Après ce temps d’incubation, les puits ont été vidés et rincés de nouveau 2 fois avec 200 µL d’eau distillée stérile. L’expérience a été poursuivie suivant la méthode classique de coloration au CV décrite ci-dessus. La déstructuration du biofilm préformé consécutive à l’oxydation des polysaccharides de la matrice du biofilm par le PI se traduit par une diminution de l’absorbance mesurée à 540 nm.

4.2.2.3.2. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm

La capacité de la protéinase K (isolée de Tritirachium album) à dégrader un biofilm préformé a été évaluée respectivement par la méthode de BFRT^®et par celle de coloration au CV.

4.2.2.3.2.1. La méthode de BFRT^®

La protéinase K a été testée sur des biofilms formés en présence du milieu BHI pendant 6 h, temps correspondant au blocage complet des billes. Le traitement a consisté en l’application de 50 µL de la solution de protéinase K (100 µg/mL) dans les puits (par-dessus le surnageant) durant 4 h à la température de 35°C avant de tester ces biofilms avec le BFRT^®.Tous les tests ont été effectués en triplicat. Des témoins positifs sans la protéinase K ont été réalisés à chaque expérience.

Si des protéines sont des constituants majeurs des biofilms, la protéinase K les dégrade, le biofilm est détruit (curatif), les particules magnétisables sont libérées et on observe l’apparition d’un spot après magnétisation. Par contre, si des protéines ne contribuent pas à la formation du biofilm, la protéinase K n’a aucun effet sur le biofilm, les particules magnétisables restent prisonnières du biofilm et il n’y a pas de spot formé au cours de la magnétisation.

67

4.2.2.3.2.2. La méthode de coloration au CV

La capacité de la protéinase K à déstructurer des biofilms préformés a été évaluée sur les biofilms de 24 h. Après 3 lavages successifs des puits, les puits contrôles ont été incubés pendant 4 h à 35°C avec 200 µL du milieu BHI-tampon Tris HCl (pH 7,0) et les puits essais avec 200 µL d’une solution de protéinase K 100 µg/mL. Après rinçage des puits, les microplaques ont été traitées suivant la technique classique de la méthode de coloration au cristal violet. La déstructuration des biofilms préformés se traduit par une diminution de la densité optique suite à la dégradation des protéines de la matrice du biofilm.

4.2.2.3.3. Etude de l’effet du periodate de sodium et de la protéinase K sur la mobilité des billes

Cette étude avait pour but de vérifier comment 10 mM de PI ou 100 µg/mL de protéinase K peuvent affecter la mobilité des billes magnétiques. Nous avons à cet effet incubé la protéinase K ou le PI avec les billes magnétiques pendant une période de 4 h, temps correspondant à la formation des biofilms jeunes par les deux méthodes. Les expériences ont été réalisées et analysées suivant la technique standard de BFRT^®. Des contrôles positifs constitués de billes magnétiques/milieu de culture ont été réalisés à chaque expérience.

4.2.2.4. Etude de l’activité de l’EGTA sur les biofilms de SASM et de SARM

4.2.2.4.1. Evaluation de l’activité de l’EGTA sur les biofilms en formation et préformés

La capacité de l’EGTA à inhiber la formation des biofilms a été testée par les deux méthodes décrites précédemment. Différentes concentrations d’EGTA ont été testées: 0,1, 0,3, 1, 3 et 10 mM. Deux concentrations d’EGTA, soit 1 et 10 mM, ont été testées sur les biofilms de 24 h par la méthode de coloration au cristal violet décrite ci-dessus.

4.2.2.4.2. Evaluation de la toxicité de l’EGTA sur les cellules eucaryotes par le test MTT 4.2.2.4.2.1. Culture des cellules

Les macrophages murins de la lignée cellulaire J.774.2 nous ont été fournis par Melle M. EL OUAALITI de notre laboratoire. Ils ont été cultivés dans des fioles de culture dans le milieu

DMEM/F-12 additionné de 10% desérum fœtal de veau inactivé par la chaleur, 2 mM de

68 ont été incubées à 37°C en atmosphère de 5% de CO₂. La croissance des cellules en suspension a été évaluée par une observation microscopique. Les cellules formant une monocouche ont été ensuite décrochées puis centrifugées à 3000 tours/min et le culot obtenu a été remis en suspension dans 2 mL de milieu DMEM/F-12. Après comptage de cellules dans une cellule hématimètre, un volume adéquat de milieu DMEM/F-12 a été de nouveau ajouté pour diluer les cellules. Deux cents µL de cette suspension ont été placés dans les puits d’une microplaque de 96 puits, puis incubés une nuit pour atteindre une densité d’environ 10⁶ cellules par puits.

4.2.2.4.2.2. Viabilité cellulaire

L’effet de l’EGTA sur la viabilité de cellules eucaryotes a été évalué en mesurant la capacité de macrophages murins à réduire le MTT. Le principe du test est basé sur la capacité de cellules métaboliquement actives à réduire le sel de tétrazolium MTT (bromure de 3 (4,5 dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) en un précipité formazan suite à l’action de la succinate déshydrogénase mitochondriale (Berridge et Tan, 1993). La couleur du milieu passe du jaune au violacé. L’intensité de la coloration est proportionnelle à l’activité de l’enzyme mitochondriale etau nombre de cellules vivantes présentes lors du test.

Après l’incubation d’une nuit, le milieu de culture a été éliminé puis remplacé par le tampon

HEPES-NaOH 10 mM contenant 150 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl_2, 1mM de

CaCl₂, 13 mM de glucose et différentes concentrations d’EGTA (1, 5, 10, 20, 50 et 100 mM). Les cellules ont été ensuite incubées pendant 20 min et le contenu des puits a été aspiré avant l’ajout de 100 µL de MTT (1 mg/mL de milieu). Après 3-4 h d’incubation, la microplaque a été centrifugée pendant 10 min à 1300 tours/min (25°C), puis 100 µL de dimethylsulfoxide (DMSO) ont été ajoutés en vue de dissoudre le précipité formé. L’absorbance a été mesurée à 540 nm au lecteur de plaques. Chaque condition a été testée en triplicat.

69

4.2.2.5. Détection de gènes codant pour IcaA et pour les protéines de surface impliquées dans la formation des biofilms

4.2.2.5.1. PCR de fragments des gènessasC, sasG, fnbA, fnbB, clfA, clfB et icaA

Les réactions de PCR ont été effectuées en vue de détecter les gènes codant pour la protéine IcaA et pour les protéines de surface des parois de différentes souches cliniques et de

référence SASMet SARM étudiées.

Les différents gènes ci-dessous ont été recherchés:

a. le gène sasC codant pour la protéine de surface C de S. aureus, b. le gène sasG codant pour la protéine de surface G de S. aureus,

c. les gènes fnbA et fnbB codant pour les protéines de liaison à la fibronectine, d. le gène clfA et clfB codant pour les protéines de liaison au fibrinogène, e. Le gène icaA codant pour la protéine IcaA.

Après extraction de l’ADN par la technique rapportée par Martín-Lopez et al. (2004), les réactions de PCR ont été réalisées avec les amorces sens et antisens reprises dans le Tableau 4.5. Chaque réaction de PCR, en fonction du gène recherché, a été effectuée dans un volume final de 50 µL. Chaque mélange réactionnel comprenait soit 0,5 µM de chaque amorce sens et antisens pour les gènes sasC, fnbA et fnbB, 2 µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène sasG, 0,4 µM de chaque amorce sens et antisens pour les gènes clfA ou clfB ou de 0,8 µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène icaA. A ces amorces ont été ajoutés 5 µL de l’extrait d’ADN génomique, 0,2 mM de chacun des 4 dNTPs, 1,25 U de Taq ADN

polymérase, 3,5 mM de chlorure de magnésium,du tampon réactionnel (67 mM Tris-HCl pH

8,8), 16 mM (NH4)2SO4) et de l’eau sans nucléase.

Les séquences ont été amplifiées dans un thermocycler (Bio-Rad icycler) en utilisant le programme suivant: dénaturation initiale à 94°C pendant 3 min, 30 cycles de PCR selon le protocole repris dans le Tableau 4.6 pour la dénaturation, l’hybridation, et l’extension des amorces respectivement, et enfin une extension finale de 10 min à 72°C. Les produits d’amplification ont été séparés par électrophorèse soit sur gel d’agarose à 1% pour icaA et clfA, soit sur gel d’agarose à 2% pour fnbA, fnbB, sasC, sasG et clfB dans du tampon TBE à

70 60 V pendant 60 min. Les gels ont ensuite été traités et analysés selon le protocole décrit au point 4.2.1.2.3.2.

Tableau 4.5: Les amorces utilisées dans les PCR

Gène ^Gen

Bank ^{Amorces Fragment Références}

sasC 2859120 ^S AS 5'- GCAACGAATCAAGCATTGG- 5'- AGACAGCACTTCGTTAGG- ^{489 pb} Schroeder et al., 2009 sasG 1193224 ^S AS 5'- GGGAACTCAACAAGAGGCAG-

5'- CAGAACGAGCTTTTCTAACC- ^{311 pb Roche et al., 2003}

fnbA 3913735 ^S AS 5'- GATACAAACCCAGGTGGTGG- 5'- TGTGCTTGACCATGCTCTTC- ^{191 pb} Mongodin et al., 2002 fnbB 3238062 S AS 5'- GGAGCGGCCTCAGTATTCTT- 5'- AGTTGATGTCGCGCTGTATG- ^{201 pb} Mongodin et al., 2002 clfA 5330438 ^S AS 5- CCGGATCCGTAGCTGCAGATGCACC-3 5- GCTCTAGATCACTCATCAGGTTGTTCAGG- ^{1000 pb} Zmantar et al., 2008 clfB 5331889 S AS 5- ACATCAGTAAATAGTAGGGGGCAAC- 5-TTCGCACTGTTTGTGTGTTTGCAC- ^{205 pb} Tristan et al., 2003 icaA NC 017340 S AS 5'-ACACTTGCTGGCGCAGTCAA

5'-TCTGGAACCAACATCCAACA 188 pb ^{Zmantar et al.,}

2008 icaA ^AF 086783 S AS 5’-AAACTTGGTGCGGTTACAGG 5’-TCTGGGCTTGACCATGTTG ^{752 pb} Martin-Lopez et al, 2004 S: sens; AS: antisens; pb: paire de bases

Tableau 4.6: Conditions des PCR

sasC sasG fnbA fnbB clfA clfB icaA

Dénaturation Temps (sec) 60 60 30 30 60 60 30 Temp. (°C) 94 94 94 94 94 94 94 Hybridation Temps (sec) 30 30 30 30 60 60 30 Temp. (°C) 50 50 55 55 55 55 55 Elongation Temps (sec) 60 60 30 30 60 60 45 Temp. (°C) 72 72 72 72 72 72 72 Nombre de cycles 30 30 30 30 30 30 30

71