Caractérisation génomique des souches de S. aureus

4.2.1.2.1. Détection de gènes codant pour l’ARNr 16S, la résistance à la méticilline et pour la thermonucléase de S. aureus par une PCR triplex

La détection de ces 3 gènes a été effectuée par une PCR multiplex qui permet l’amplification simultanée de plusieurs séquences cibles dans un même tube d’amplification. Chaque amplification doit être, dans le même tube, indépendante des autres, le résultat devant être identique à celui obtenu isolément dans un tube avec un seul couple d’amorces. Dans le cas d’espèce, la PCR multiplex utilisée permet la détection de gènes suivants:

- le gène mecA qui révèle un des mécanismes de résistance à l’oxacilline. L’expression du gène mecA code pour la PBP2a, une protéine modifiée de liaison aux pénicillines, possédant une faible affinité pour les bêta-lactamines,

- le gène nuc codant pour une thermonucléase spécifique de S. aureus et qui révèle la présence d’un S. aureus,

- La détection du gène ARNr 16S, spécifique du genre Staphylococcus et qui sert de contrôle de qualité interne.

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4.2.1.2.1.1. Extraction de l’ADN

L’extraction de l’ADN a été réalisée selon le protocole décrit par Unal et al. (1992). Les cellules bactériennes provenant d’une gélose Columbia additionnée de 5% de sang de mouton ont été incubées pendant 10 min à 37°C avec 50 µL de lysostaphine 100 µg/mL. Une deuxième incubation a été réalisée pendant 10 min à 37°C avec 150 µL de protéinase K 100 µg/mL préparée dans du tampon Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5). Les cellules ont été ensuite portées à ébullition pendant 5 min à 95°C, puis centrifugées à 8000 g pendant 5 min. Le lysat bactérien obtenu contenant de l’ADN a été utilisé pour la réaction d’amplification par PCR.

4.2.1.2.1.2. PCR triplex ARNr 16S, mecA et nuc

La PCR triplex a été réalisée selon le protocole décrit par Maes et al. (2002). La réaction de PCR a été effectuée dans un mélange réactionnel de 50 µL contenant le tampon de PCR 1X (Perkin-Elmer Applied Biosystem, Foster City, Californie), 2 mM de MgCl2, 0,6 µM de chaque amorce sens et antisens spécifique à l’ARNr 16S, 0,4 µM de chaque amorce sens et

antisens spécifiques à mecA et nuc respectivement (Amersham Pharmacia Biotech,

Roosendaal, Hollande), 250 µM de chacun des 4 dNTPs, 2 U de Taq ADN polymérase et de 5 µL de lysat bactérien. Les conditions d’amplification comprenaient une dénaturation initiale à 95°C pendant 15 min suivie de 25 cycles de dénaturation (30 sec à 95°C), hydridation (90 sec à 57°C), extension (90 sec à 72°C) et une extension finale à 72°C pendant 10 min. Les fragments amplifiés ont été séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5% dans du TBE 1 X additionné de bromure d’éthidium. Les amorces utilisées sont reprises dans le Tableau 4.2.

Tableau 4.2: Les amorces utilisées dans la PCR multiplex

Gène GenBank Amorces Fragment

mecA X 52593 S 5'- AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC- 533 pb AS 5'- AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC- nuc DQ 507381 S 5' GCGATTGATGGTGATACGGTT- 279 pb AS 5'- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC- ARNr16S NR 037007 S 5’- GTTATTAGGGAAGAACATATGTG- 750 pb AS 5’- CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC

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4.2.1.2.2. Typage moléculaire des souches de S. aureus par spa typing

L’analyse des répétitions présentes dans la séquence codant pour la protéine A de S. aureus (spa typing) a été effectuée suivant la méthode décrite par Hallin et al. (2007). Cette technique consiste à séquencer une région contenant un nombre variable de séquences répétées en tandem ou « repeat » de la région X de la protéine A (gène spa) (voir Figure 2.5). Le logiciel Ridom StaphType (Ridom GmbH, Allemagne) permet l’analyse de ces séquences par la détermination automatique de ces éléments répétés, l’analyse de ces éléments et, finalement l’attribution d’un profil (spa type). Le principe de la méthode consiste à réaliser une PCR de type end-point permettant d’amplifier la région spa et de séquencer l’amplicon spa obtenu.

4.2.1.2.2.1. Extraction de l’ADN

L’extraction de l’ADN a été effectuée selon le protocole décrit au paragraphe précédent.

4.2.1.2.2.2. PCR de la région X du gène spa

La réaction de PCR s’est réalisée dans un volume final de 25 µL contenant 12,5 µLde master mix PCR multiplex Qiagen, 3 µL de lysat bactérien, 10 µM des amorces sens (spa-1113) et antisens (spa-1514) (0,5 µL respectivement) et 8,5 µL d’eau apyrogène. Les amorces classiques utilisées étaient les suivantes (voir Figure 2.5): amorce sens spa-1113 (5’-TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C - 3’) et amorce antisens spa-1514 (5’-CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT- 3’) (Aires-de-Sousa et al., 2006).

Le protocole d’une PCR de type end-point a été utilisé. Les séquences ont été amplifiées en deux phases: (1) les échantillons ont subi une dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min suivie de 3 cycles de dénaturation à 94°C pendant 1 min, hydridation à 55°C pendant 2 min et extension des amorces à 72°C pendant 1 min, (2) puis 30 cycles de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, hydridation à 55°C pendant 1 min, extension des amorces à 72°C pendant 2 min, et enfin une extension finale à 72°C pendant 7 min. Les produits d’amplification ont été révélés sur l’automate QIaxel (Qiagen).

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4.2.1.2.2.3. Séquençage de l’ADN

La méthode de séquençage utilisée est celle décrite par Sanger et al. (1977). Le principe de cette méthode consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l'aide d'un oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer. L’élongation de l’amorce est réalisée par l’action enzymatique d’une polymérase thermostable comme celle utilisée pour la PCR (Taq ADN polymérase). Les quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés, ainsi qu’une faible concentration de quatre didésoxyribonucléotides (ddNTP) (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). Chaque ddNTP est marqué par une molécule fluorescente distincte. Ces didésoxyribonucléotides agissent comme des terminateurs de chaîne: une fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils empêchent la poursuite de l’élongation. Cette terminaison se fait spécifiquement au niveau des nucléotides correspondant aux didésoxyribonucléotides marqués incorporés dans la réaction. La terminaison se fait de manière statistique suivant que l'ADN polymérase utilise un dNTP ou un ddNTP. Il en résulte un mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes, qui se terminent tous au niveau d'un ddNTP. Ces fragments sont ensuite séparés sur le séquenceur d’ADN qui permet de détecter automatiquement le traceur fluorescent incorporé dans l’ADN.

La séquence d’acide nucléique est déduite des mobilités électrophorétiques des différents produits d’extension résultant de la réaction. La réaction de séquençage est réalisée dans un thermocycleur de PCR de type end-point.

4.2.1.2.2.4. PCR de séquençage

La réaction de séquençage a été réalisée dans un volume final de 10 µL. Un mélange réactionnel de 6 µL contenant 2,5 µL d’eau apyrogène, 2 µL de Big Dye Terminator DNA sequencing kit V1.1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Allemagne), 1 µL de tampon fourni par le kit de séquençage et 10 µM de l’amorce de séquençage (0,5 µL) sont déposés sur une microplaque préconisée pour la PCR. A ce mélange réactionnel sont ajoutés 4 µL de produit PCR dilué au 1/10 dans de l’eau apyrogène. Les conditions d’amplification étaient les suivantes: un cycle de dénaturation à 96°C pendant 2 min suivi de 25 cycles de dénaturation (30 sec à 96°C), hybridation (15 sec à 50°C), extension (1 min à 60°C).

Les produits de séquençage ont été purifiés par le kit SOPACHEM. Les séquences ont été obtenues en utilisant le séquenceur automatique d’ADN ABI 3100 Avant Genetic Analyser (Applied Biosystems, Darmstadt, Allemagne). Les types spa ont été déterminés en utilisant le

58 logiciel Ridom StaphType qui détecte automatiquement les répétitions spa et attribue un type spa selon Hallin et al. (2007).

Remarque: Les expériences portant sur la PCR triplex et le typage moléculaire par spa typing

ont été réalisées par le Centre national de référence Staphylococcus aureus du laboratoire de microbiologie de l’Hôpital Erasme.

4.2.1.2.3. Détection du gène gap, et des gènes impliqués dans la résistance à la méticilline et à la mupirocine

4.2.1.2.3.1. Extraction de l’ADN

L’extraction de l’ADN a été réalisée selon la méthode décrite par Martín-Lopez et al. (2004) de la façon suivante: après culture pendant une nuit des différentes souches de SARM et SASM sur une gélose TSA, une à deux colonies isolées ont été placées dans 20 mL d’eau distillée stérile. La suspension obtenue a été chauffée à 100°C pendant 20 min. De cette suspension, un aliquote de 5 µL a été utilisé directement pour la réaction d’amplification par PCR.

4.2.1.2.3.2. PCR de fragments des gènesgap, mecA, femB, ileS-2 (mupR)

Les réactions de polymérisation en chaine ont été effectuées pour rechercher:

a. le gène gap codant pour la glycéraldéhyde - 3 - phosphate déshydrogénase, b. le gène mecA codant pour la résistance à la méticilline,

c. le gène femB impliqué dans l’expression de la résistance à la méticilline, d. le gène ileS-2 ou mupR impliqué dans la résistance à la mupirocine.

Les séquences des amorces sens et antisens correspondant aux 4 gènes sont reprises dans le Tableau 4.3.Chaque réaction de PCR, en fonction du gène recherché, a été effectuée dans un volume final de 50 µL contenant soit 0,8 µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène gap, 0,1 µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène mecA, 3,6 µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène femB ou de 0,2 µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène ileS-2, 5 µL de solution contenant de l’ADN génomique, 0,2 mM de chacun des 4 dNTPs, 1,25 U de Taq ADN polymérase, du tampon réactionnel (16 mM de sulfate

59 d’ammonium, 67 mM de Tris-HCl pH 8,8), 3,5 mM de chlorure de magnésium et de l’eau sans nucléase. Le protocole d’une PCR hot start a été utilisé. Les séquences ont été amplifiées dans un thermocycler (Bio-Rad icycler) en utilisant le programme suivant: dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min, dénaturation, hybridation, extension des amorces selon les protocoles repris dans le Tableau 4.4 et une extension finale de 10 min à 72°C.

Les produits d’amplification ont été séparés par électrophorèse soit sur gel d’agarose à 2% pour les gènes femB, mupR et mecA, soit sur gel d’agarose à 1% pour le gène gap dans du tampon TBE à 60 V pendant 60 min. Les gels ont ensuite été colorés avec du GelRed (VWR, Leuven, Belgique), puis visualisés sous lumière UV dans le Chemidoc XRS⁺ (BioRad, Nazareth, Belgique). La taille des fragments amplifiés a été estimée en comparaison avec un marqueur de 100 pb (GeneRuler 100-bp DNA ladder plus, Fermentas, Hanover, MD, Etats-Unis d’Amérique).

Tableau 4.3: Amorces utilisées dans les PCR

Gène Gen Bank

Amorces Fragment Références

gap 1123535 ^S AS 5'-ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA 5'-GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ^{934 bp} Yugueros et al., 2000 femB X17688 ^S AS 5'-TTACAGAGTTAACTGTTACC 5'-ATACAAATCCAGCACGCTCT ^{651 pb} Martin-Lopez et al., 2004 mupR X75439 ^S AS 5'-TATATTATGCGATGGAAGGTTGG 5'-AATAAAATCAGCTGGAAAGTGTTG ^{458 pb} Martin-Lopez et al., 2004 mecA Y00688 ^S AS 5'-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA 5'-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA ^{310 pb} Martin-Lopez et al., 2004 S: Sens; AS: Antisens; pb: paires de base

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Tableau 4.4: Conditions des PCR

gap fembB + mupA + mecA

Dénaturation Temps (sec) 30 30 45 45 Temp. (°C) 94 94 94 94 Hybridation Temps (sec) 30 45 45 45 Temp. (°C) 55 66 64 50 Elongation Temps (sec) 45 60 60 60 Temp. (°C) 72 72 72 72 Nombre de cycles 35 10 5 25