Adhésion et formation du biofilm par BFRT ® et méthode basée sur la coloration au

CV

Différentes méthodes ont été développées pour évaluer in vitro l’adhésion bactérienne à une surface. L’adhésion et les étapes initiales de formation des biofilms peuvent donc être étudiées dans des réacteurs spécifiques conçus pour la culture de biofilms. Nous pouvons citer à titre d’exemples les cellules d’écoulement (Caldwell et Lawrence, 1988; Lawrence et al., 1991), le réacteur annulaire rotatif (Escher et Characklis, 1990), le réacteur tubulaire (l’appareil de Robbins) (Vorachit et al., 1993), le réacteur à biofilm CDC (Murga et al., 2001; Nagant et al., 2012) dans lesquels les biofilms peuvent se former et être continuellement approvisionnés en nutriments. Ces réacteurs présentent plusieurs désavantages, notamment leur petite surface rendant le prélèvement direct du biofilm impossible, l’obtention d’une faible quantité du biofilm fixé à la surface par rapport au volume initial. Les biofilms formés dans ces réacteurs et sur les implants médicaux peuvent être facilement observés par des techniques microscopiques (Surman et al., 1996; Burnet et al., 2000; Kodjikian et al., 2003; Senechal et al., 2004). Mais ces techniques restent purement qualitatives et descriptives et ne peuvent mesurer l’adhésion bactérienne (Xavier et al., 2003). Les méthodes de dénombrement de cellules sont également utilisées (Anwar et al., 1992; Oulahal et al., 2004), mais elles ne donnent qu’une indication sur le nombre de cellules se trouvant à l’intérieur du biofilm. La méthode de culture en microplaques après coloration au cristal violet est actuellement la plus utilisée pour évaluer l’adhésion bactérienne et la formation du biofilm (Christensen et al., 1985).

Dans ce travail, nous avons utilisé deux méthodes basées sur la culture de bactéries en microplaque pour étudier la capacité de souches de S. aureus à adhérer à une surface inerte et à former les biofilms. Il s’agit du BFRT®

et de la méthode de coloration au cristal violet. Le BFRT^® évalue la capacité de cellules bactériennes à immobiliser les billes magnétiques. Cette méthode, de mise en œuvre simple et rapide, nécessite peu de manipulations et sa procédure n’inclut pas les différentes étapes de lavage de puits. Elle a été utilisée avec succès par Chavant et al. (2007) dans l’étude de formation d’un biofilm par les bactéries et les microalgues (Badel et al., 2008). Les résultats de nos expériences ont montré que cette méthode était la plus efficiente et la mieux indiquée pour une évaluation rapide de l’adhésion bactérienne sur une surface en dehors de toute influence de la croissance bactérienne.

123 Le BFRT^® nous a également permis de démontrer que les souches SASM adhéraient plus rapidement sur une surface que les souches SARM. Grinholc et al. (2007) et Atshan et al. (2012) ont montré que les souches SASM étaient plus susceptibles à adhérer à une surface et à former les biofilms que les souches SARM. Nos résultats corroborent également ceux obtenus par O’Neill et al. (2007). Ces auteurs ont rapporté que la capacité des souches cliniques de S. aureus à former un biofilm dans un milieu de culture contenant du NaCl était plus importante chez les SASM que chez les SARM. Leurs résultats suggéraient aussi que différents mécanismes intervenaient dans la formation des biofilms des SASM et des SARM. La forte adhérence des SASM à la surface pourrait également être attribuée à la forte hydrophobicité de leur membrane telle que mis en évidence par le test MATS. Il convient cependant de souligner que des opinions divergentes existent à ce sujet. En effet, les travaux d’Amaral et al. (2005) ont montré que l’adhésion de souches SARM aux cellules épithéliales bronchiques était plus importante que celle de souches SASM. Plus récemment, Pozzi et al. (2012) ont montré que l’expression du gène de résistance à la méticilline était associée avec une forte adhésion sur un cathéter. A l’opposé, Aathithan et al. (2001) ont rapporté la similarité d’adhésion de SARM et SASM sur les cellules épithéliales du foie. Par contre, l’adhésion de SARM sur les cellules épithéliales respiratoires était inférieure à celle de SASM d’après les travaux de Karauzum et al. (2008).

La méthode de coloration au CV est basée sur une mesure colorimétrique du cristal violet incorporé à la fois par les cellules attachées sur les puits et par la matrice organique formant le biofilm. Elle a été modifiée pour augmenter sa précision et sa reproductibilité (Stepanovic et al., 2000; Peeters et al., 2008). Les résultats de nos travaux ont montré qu’elle était de faible sensibilité et nécessitait des temps d’incubation plus longs pour observer une augmentation significative de l’absorbance. Malheureusement, le manque de standardisation de différentes étapes de lavage de puits rend souvent difficile la comparaison des résultats de différents laboratoires (Chavant et al., 2007).

En utilisant ces deux méthodes, Nagant et al. (2010) avaient montré la cohérence des résultats obtenus lorsqu’on étudie l’étape initiale de formation du biofilm par les souches cliniques et de référence de Pseudomonas aeruginosa, mais à condition que la mesure de la formation du biofilm se fasse en peu de temps. Ceci a été également observé dans nos travaux (Figures 5.9 à 14).

124 Le BFRT^® est une méthode facile et reproductible pour examiner rapidement l’adhésion et la formation d’un biofilm, mais les résultats de nos études montrent aussi que cette méthode est rapidement saturable et ne peut donner une estimation de la quantité du biofilm formé à des temps dépassant 4 à 6 h. En effet, la formation d’un biofilm plus important ne peut être détectée que par la méthode de coloration au CV. C’était le cas du biofilm formé dans notre étude par la souche 018/FV après 24 h d’incubation (Figure 5.20). Cette souche de croissance lente (temps de doublement plus long) avait formé un biofilm plus important que ceux de toutes les autres souches.

La matrice des biofilms de staphylocoques est constituée en grande partie du PIA/PGNA et des protéines (Götz, 2002). Nous avons utilisé le PI et la protéinase K pour explorer respectivement la contribution des polysaccharides et des protéines dans la matrice du biofilm par leBFRT^® et par la méthode de coloration au CV.

Avec le BFRT^®, les expériences préliminaires consistaient à examiner l’influence de ces deux traitements sur l’immobilisation des billes magnétiques. Les résultats obtenus avaient montré que le PI n’avait pas un effet significatif sur l’immobilisation de billes, tandis que la protéinase K provoquait une chute massive du BFI suggérant ainsi une immobilisation complète des billes magnétiques. Les forces électrostatiques entre les billes chargées négativement et la protéine ne sembleraient pas être responsables de cette interaction. Des interactions inattendues entre un composant du milieu de culture avec les billes avaient déjà été observées par Badel et al. (2008; 2011). Ces auteurs avaient rapporté que certains milieux de culture ayant une force ionique élevée pouvaient diminuer la mobilité de billes. En dépit de cette interaction, les résultats obtenus par le BFRT avaient montré que les biofilms préformés étaient déstructurés par la protéinase K suite à la disparition de l’interaction et à une augmentation du BFI. Cette déstructuration avait également été confirmée par la méthode de coloration au CV. Ces résultats corroboraient ceux obtenus par Cucarella et al. (2001) sur les mécanismes de formation des biofilms dépendant de protéines.

La contribution de sucres dans le mécanisme de formation du biofilm a été testée en incubant les bactéries avec le PI. Ce dernier oxyde les liaisons covalentes entre deux carbones adjacents portant les groupes hydroxyles et clive les liaisons C3-C4 des résidus N-acétylglucosamine. Les résultats obtenus par le BFRT et par la méthode de coloration au CV ont montré une inhibition de la formation des biofilms pour toutes les souches testées.

125 En vue de confirmer la présence des polysaccharides dans la matrice des biofilms de S. aureus, un des gènes codant pour l’opéron ica a été recherché par PCR. Le gène icaA était détecté dans toutes les 5 souches SARM, dans les 4 souches de SASM2 et dans la souche de référence ATCC 25923. Toutes les souches SASM1étaient négatives pour le gène icaA. Les études de dégradation des biofilms de SARM, SASM1 et de SASM2 par le PI avaient également confirmé les résultats de PCR. Les biofilms de souches icaA⁺ étaient déstructurés par 10 mM de PI contrairement aux souches icaA^-. La souche de référence ATCC 25923 était plus sensible à l’action du PI (P < 0.001). L’insensibilité des souches SASM1 au PI pourrait s’expliquer par l’absence du gène icaA dans la structure de leur biofilm. Il est bien établi que l’expression de l’opéron ica se traduit par une augmentation de la formation des biofilms dans la majorité (Gad et al., 2009), mais pas dans toutes les souches de S. aureus (O’Gara et al., 2007). Des mécanismes de formation des biofilms indépendants de l’opéron ica par les souches cliniques de S. aureus sensibles à la méticilline avaient été mis en évidence par Fitzpatrick et al. (2005) et O’Neill et al. (2007). Nos résultats sont en contradiction avec ceux rapportés par ces auteurs en ce qui concerne les souches SASM1, mais conformes à ceux obtenus par Petrelli et al. (2008) dans lesquels une souche clinique de SASM était négative pour l’opéron icaA. En effet, la présence du gène icaA n’est pas toujours corrélée avec la formation d’un biofilm in vitro (Nasr et al., 2012).