II. DETERMINANTS GENETIQUES DES COMPLICATIONS DU DIABETE
3. Identifier la région du génome impliquée
3.2. Etudes d’association (ou association studies)
Les études d’association ont pour but de détecter une association d’un ou plusieurs polymorphismes génétiques et des marqueurs de la maladie qui peuvent être quantitatifs ou qualitatifs (comme la présence ou la survenue d’une maladie en étudiant la prévalence dans les études transversales ou l’incidence dans les études prospectives).
Il s’agit donc de comparer des fréquences (génotypique, allélique ou haplotypique) de marqueurs génétiques choisis au préalable entre des malades et des témoins (qui n’ont pas de lien familial a contrario des études de liaison). L’approche de type « gène-candidat » définit a priori les gènes à tester. Ces gènes codent pour des protéines connues pour être impliquées a priori dans la physiopathologie de la maladie.
Ces études peuvent identifier des marqueurs liés avec la maladie et/ou le phénotype. Certaines associations identifient un marqueur non causal (marqueur intermédiaire ou surrogate marker) qui est soit lié à un locus causal pas encore découvert soit un authentique faux positif dû à des facteurs confondants.
Les études d’association ont fait suite aux études de liaison en proposant une exploration plus fine des régions du génome, avec une puissance de détection supérieure sur des populations plus importantes d’individus indépendants entre eux. Elles s’appuient notamment sur les loci précédemment détectés et permettent de tester jusqu’à plusieurs centaines de milliers de variants.
L’intensité du LD est mesurée pour 2 loci avec le coefficient D. Certains auteurs utilisent le coefficient D’ qui correspond à une standardisation de D.
D’ varie entre -1 et 1 (D’=1 : déséquilibre complet ; D’=0 : équilibre de liaison). Le coefficient de corrélation r² est également utilisé et le seuil de 0,8 est en pratique considéré pour définir 2 loci en LD.
Il existe au sein du génome des zones en fort LD (blocs en LD ou blocs haplotypiques) qui peuvent s’étendre jusqu'à plusieurs centaines de kb et au sein desquels il n’existe qu’une faible diversité haplotypique. Par ailleurs, certains allèles dont les loci espacés de plusieurs kb et séparés par des loci en équilibre de liaison peuvent être eux-mêmes en LD.
Des outils comme Haploview permettent d’obtenir une représentation graphique de ces notions de bloc de LD en proposant un code couleur informatif (Figure 17).
Figure 17 Schéma des blocs en déséquilibre de liaison dans le gène CYP19A1.
Données issues des populations CEU du site HapMap (http://www.hapmap.org). Les triangles noirs représentent les blocs en LD. Les points sont créés en utilisant Haploview et le code couleur des points est le suivant : blanc=(|D’|<1, LOD<2), rose/rouge ombré=(|D’|<1, LOD#2), bleu=(|D’|=1, LOD<2), rouge vif=(|D’|=1, LOD#2).
Des SNPs marqueurs (ou tag SNPs), au sein d'un haplotype ou d’un bloc en LD, sont choisis pour constituer un identificateur de cet haplotype.
Cette sélection peut être menée grâce au logiciel Haploview132 (Figure 18) mais d’autres outils existent comme le serveur web « Tagger » du Broad Institue (http://www.broadinstitute.org/mpg/tagger/server.html133) ou le Genome
variation server (http://gvs.gs.washington.edu/GVS134/index.jsp)
Figure 18 Représentation de SNPs taggants (indiqués au dessus des colonnes de SNP par un triangle gris plein) à partir du logiciel Haploview.
Les mêmes données que la figure 17 ont été, ici , utilisées. Les nombres en gris représentent la fréquence de l’haplotype considéré (lecture en ligne). Dans le 1er bloc, 6 SNPs sont taggant (#1, #3, #4, #6, #7 et #9), 2 dans le 2e bloc (#11 et #12) et 4 dans le 3e bloc (#16, #17, #18 et #20).
Il existe des tests d’association basés sur des études familiales qui proposent d’explorer dans le même temps la liaison génétique comme le test du
déséquilibre de transmission (TDT pour transmission disequilibrium test)134 en choisissant des témoins au sein des familles des cas. Ce test est réalisé dans des triades de deux parents et d’un enfant. La distribution des allèles transmis par des parents hétérozygotes (en effet les parents homozygotes ne sont pas considérés car cela représente une situation non informative) aux descendants atteints est comparée avec la distribution attendue des allèles parmi les descendants. Il a ainsi été possible d’explorer l’association entre la ND et plusieurs centaines de gènes d’intérêt135,136.
Le test du déséquilibre de transmission entre germains (S-TDT pour Sib
transmission disequilibrium test)137 utilise l’information provenant d’un seul
enfant malade et d’un enfant sain avec des génotypes différents dans un ensemble de familles non-apparentées.
Nous proposons de présenter les études d’association génétique réalisées dans le champ des complications du diabète en fonction des voies métaboliques explorées. Nous allons dans un premier temps écrire les travaux menés dans les voies liées à la glucotoxicité ainsi qu’aux voies impliquant la glycorégulation. Dans un second temps, nous regarderons les voies métaboliques impliquées dans les pathologies cardiovasculaires et la régulation de la pression artérielle.
A.
Gènes candidats de la glucotoxicité
La glucotoxicité liée à l’hyperglycémie chronique exerce son effet toxique par différentes voies (Figure 19) :
- la voie des polyols, - la voie des héxosamines,
- le stress oxydatif et la production de produits avancés de la glycation, - la voie de la protéine kinase C.
Chacune de ces voies métaboliques ont été également largement ciblées par des études d’association.
Figure 19 Voies métaboliques impliquées dans la toxicité de l’hyperglycémie (source Brownlee M Nature 2001)
Variants génétiques de la voie de la poly (ADP-ribose) polymérase
L’hyperglycémie entraîne une augmentation de la production d’espèces oxygénées réactives qui, à leur tour, activent la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP). Le schéma de la Figure 20, emprunté à Brown et al., décrit un mécanisme unifié de lésions cellulaires induites par l’hyperglycémie pour lequel PARP joue un rôle central. Pour autant, les variants génétiques du gène PARP semblent avoir été assez peu investigués jusqu’à maintenant sauf dans une population de sujets DT1 russes, dans laquelle a été mise en évidence l’association avec les polynévrites138.
Figure 20 Voies métaboliques impliquées dans la toxicité de l’hyperglycémie au travers de l’augmentation de PARP (source Brownlee M Diabetes 2005)
La gluco-toxicité est également responsable de production d’espèces oxygénées réactives ou ROS (pour Reactive Oxygen Species) dont la famille des superoxides dismutases (SOD) assure la détoxification. Il a été mis en évidence l’implication de certains variants de SOD1 qui code pour la SOD mitochondriale et la survenue de ND dans le DT1139 et dans le DT2140-142.
Le gène SOD2, qui code pour la SOD cytoplasmique, a été associé, pour certains de ces variants, avec la ND dont le V16A143 et le C47T144 mais également pour ce qui est de la RD et le V16A145,146.
Variants génétiques de la voie des polyols
En présence d'une hyperglycémie chronique, le glucose intra cellulaire est réduit en sorbitol sous l’action de l’aldose réductase en présence de NADPH. La sorbitol-déshydrogénase (SDH) catalyse ensuite la transformation du sorbitol en fructose en réduisant NAD+ en NADH (Figure 21).
Figure 21 Voie des polyols (source
Les polyols provoquent : • des dégâts osmotiqu • une diminution de l’a • une augmentation du
activation de PKC, • une diminution de l
PARP activé ce qui e L’Aldose réductase, l’enzym (également nommé ADR, présente des variants d’inté et -106(C/T)) mais égaleme Certaines données de la litt de AKR1B1 et la rétinopath neuropathie155.
Pour ce qui concerne la ND
158. Néanmoins l’ensemble
potentiel thérapeutique théo Variants génétiques de la La voie d’activation de la p bénéficié d’exploration atten pour ses voies d’aval i
synthase)161-175, le VEGF et
ce Brownlee M Nature 2001)
ques,
l’activité Na+/K+ ATPase,
du rapport cytosolique NADH/NAD+ qui a
la concentration de NAD+ qui est con i entraine in fine une majoration du stress o
yme clé de la voie est codée par le gè
, ALDR1, ALR2, AR) localisé en 7q35.
térêt dans la région promotrice 5’ (microsa ent des variants intra géniques.
térature font état d’une association entre thie diabétique dans le DT1147-149 et le DT
D, des données contradictoires ont été pu le de ces données d’association montre l éorique de molécules ciblant la voie des po la voie protéine Kinase C
protéine Kinase C (PKC), présenté en F tentive tant au niveau de la superfamille PK impliquant eNOS (pour endothelial
et le Transforming Growth Factor-Beta (TG
aboutit à une onsommé par s oxydant. ène AKR1B1 5. Ce dernier satellite (CA)n e des variants T2150-154 et la publiées124,156- l’intérêt et le polyols. Figure 22, a PKC159,160 que nitric oxide TGF-β)176-184.
Figure 22 Conséquences de l'activation de la Protéine Kinase C (PKC) induite par l'hyperglycémie (source : Brownlee M Nature 2001)
Variants génétiques de la voie RAGE et produits de la glycation avancée
L’hyperglycémie chronique induit une glycation non enzymatique des protéines de l’organisme et ces produits avancés de la glycation (ou AGE pour advanced glycation end product) vont avoir des conséquences, représentées schématiquement en Figure 23, en agissant sur :
• les protéines intracellulaires en altérant leurs fonctions,
• les protéines de la matrice extracellulaire en provoquant une altération des interactions cellule-cellule et cellule-matrice,
• les protéines plasmatiques qui peuvent alors se lier au récepteur des AGE (RAGE) et activer via les ROS (pour reactive oxygen species) et NF-κB la production de facteurs de croissance et cytokines pro- inflammatoires.
La protéine RAGE est codée par le gène RAGE (également appelé AGER) qui est situé en 6p21.3
Figure 23 Voie métabolique des produits avancés de la glycation (AGE) (source Brownlee M Nature 2001)
Encore une fois une littérature profuse, parfois contradictoire, a exploré dans plusieurs groupes ethniques l’association entre de nombreux variants du RAGE et les complications rénales185-188, rétiniennes174,189-193 ou cardiovasculaires194,195 du diabète.
Une récente méta-analyse n’a cependant pas confirmé l’association entre les 3 variants Gly82Ser, 1704G/T et 429T/C de RAGE et le risque de ND et de RD196.
B.
Gènes candidats de la régulation de la pression
artérielle et des complications cardiovasculaires
Le présent travail n’a pas vocation à proposer une revue exhaustive des travaux menés sur les déterminants génétiques des complications cardiovasculaires du diabète. Néanmoins, nous approcherons ces gènes- candidats grâce à deux exemples détaillés de systèmes impactant la survenue de complications cardiovasculaires au travers de la régulation de la pression artérielle que sont le système rénine-angiotensine et le système des peptides natriurétiques. Nous avons fait le choix de ne pas détailler d’autres systèmes impliqués comme celui du système nerveux sympathique, celui de la dysfonction endothéliale, celui des médiateurs de l’inflammation mais également celui des échangeurs/transporteurs/canaux ioniques ou celui des messagers intracellulaires, pour ne citer que ceux-là.
Variants génétiques du système Rénine-Angiotensine
Le SRA joue un rôle clé dans la régulation de la pression artérielle et l'homéostasie hydrosodée.
L'angiotensinogène (AGT), synthétisé principalement par le foie, est clivé par la rénine (REN), produite par l’apparel juxta-glomérulaire en angiotensine I. Cette dernière est à son tour clivée par l'enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE) pour former l'angiotensine II, la molécule majeure de l'effecteur RAS. Les effets biologiques de l'angiotensine II sont médiés par des récepteurs de surface cellulaire qui sont pharmacologiquement définis comme de type 1 (AT1R) et de type 2 (AT2R) qui ont une homologie de 30%. Ces récepteurs, situés dans les tissus tels que les glandes surrénales, les reins, le cœur, le cerveau et les muscles lisses vasculaires, appartiennent à la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G. Les composants majeurs du SRA sont présentés dans la Figure 24.
Figure 24 Shéma des acteurs du du système rénine-angiotensine (d’apres KEGG [Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes] Kanehisa Laboratories web-database disponible sur www.genome.jp/kegg/)
Les fonctions physiologiques de de l'angiotensine II (via les AT1R) ne se limitent pour autant pas à la régulation pressive et hydrosodée puis qu’elle a également un effet procoagulant/pro-inflammatoire, sur l’hypertrophie et la fibrose et un effet cardiqueinotrope et chronotrope (Figure 25).
Figure 25 Effet du système Rénine-Angiotensine sur les différents organes cibles.
ACE : enzyme de convertion de l’angiotensine (angiotensin-converting enzyme);CNS : système nerveux central (central nervous system); NO : nitric oxide; RAS : système rénine-angiotensine (renin–angiotensin system); ROS : espèces réactives oxygénée (reactive oxygen species); SNS : systeme nerveux sympathique (sympathetic nervous system) ; VSMC : cellule vacsculaire musculaire lisse (vascular smooth muscle cells).
(Source McFarlan Am J Cardiol 2003)
Les gènes codants pour les principaux composants du SRA sont représentés sur la Figure 26.
Figure 26 Localisation chromosomique des gènes des principaux acteurs du système Rénine- Angiotensine-Aldostérone : REN : rénine, RENBP : N-acylglucosamine 2-epimerase AGT : angiotensinogène, AGTR1 : récepteur de type 1 à l’angiotensine II, AGTR2 : récepteur de type 2 à l’angiotensine II, ACE : enzyme de conversion de l’angiotensine, ACE2 : enzyme de conversion de l’angiotensine de type II, CYP11B2 : aldostérone synthase, NR3C2 : récepteur des minéralo- corticoïdes et de l’aldostérone (d’apres Ensembl release 69 (oct 2012) disponible sur http://www.ensembl.org/)
Une littérature abondante a cherché à identifier l’impact des gènes des acteurs du SRA et nous détaillerons ici, par choix, uniquement les résultats concernant les trois principaux acteurs que sont ACE, AGT et AGT1R.
ACE
Pour l’ACE, le variant d’insertion/délétion situé dans l’intron16 (rs4344) a été clairement associé dans le DT1 et le DT2 avec la ND, ce qu’a encore confirmé une récente méta-analyse de plus de 26 000 sujets197. Ce variant a également
été associé avec le déclin du DFGe198,199 et l’apparition de l’IRCT200. Enfin, il a été montré des interactions gène-gène entre le variant d’insertion/délétion d’ACE et d’autres variants de gènes du système RAA198,201 ou des variants de
gènes de la voie de signalisation de l’insuline199. AGT
La littérature est également abondante concernant le gène de l’angiotensinogène pour lequel un variant plus que les autres a été exploré (M235T ou rs699). Les résultats pour ce variant sont néanmoins contradictoires puisque nombre de travaux dans le DT1 et le DT2 identifient une association positive avec le risque de ND147,197,198,202-206 tandis que l’on peut souligner les
papiers négatifs en miroir201,207-214. AGT1R
Pour le gène du récepteur de type 1 de l’angiotensine 2, un variant a retenu l’attention de nombreux auteurs (A1166C ou rs5186). Il semble que ce SNP soit associé dans le DT2 avec la néphropathie diabétique215-219 tandis que dans le DT1 les résultats sont plus contrastés201,220.
Variants génétiques du système des peptides natriurétiques
Le système des peptides natriurétiques est composé de 3 ligands principaux : ANP (pour Atrial Natriuretic Peptide), BNP (pour Brain Natriuretic Peptide) et CNP (pour C-type Natriuretic Peptide). Les peptides natriurétiques ont une structure commune annulaire de 17 acides aminés (AA). ANP et BNP sont essentiellement produits par les cardiomyocytes tandis que le CNP est principalement sécrété au niveau du système nerveux central et de l’endothélium vasculaire.
Ces ligands agissent par couplage à 3 récepteurs membranaires NPRA, NPRB, NPRC dont l’affinité pour les ligands est différentes : NPRA : ANP≥BNP>>CNP; NPRB : CNP>>ANP≥BNP et NPRC : ANP≥CNP> BNP (Figure 27).
Figure 27 Représentation de l’affinité des ligands et des récepteurs du système des peptides natriurétiques (source : Nakayama T Endocr J. 2005)
Leurs fonctions physiologiques (Figure 28) ne se limitent pourtant pas à la régulation pressive puis qu’ils ont également un impact au niveau :
• de l’endothélium vasculaire en augmentant sa perméabilité et sa vasodilatation,
• du cœur en inhibant l’hypertrophie des cardiomyocytes ainsi que le remodelage et la fibrose cardiaque,
• du rein en diminuant la réabsorption hydrosodée tubulaire, en augmentant la filtration glomérulaire et en diminuant la production de rénine par l’appareil juxta-glomérulaire,
• des surrénales en inhibition de la production d’aldostérone, • du tissu adipeux en stimulant la lipolyse,
• du système immunitaire en participant à sa modulation,
• des chondrocytes et des ostéoblastes/clastes en favorisant la croissance.
Figure 28 Représentation des effets du système des peptides natriurétiques (source: Potter LR Endocr Rev 2006)
Le rôle des peptides natriurétiques et notamment de l’ANP a été mis en avant dans la physiopathologie de l’HTA. Il a été montré chez des volontaires sains que la perfusion d’AMP diminuait significativement la pression artérielle et augmentait de manière marquée l’excrétion urinaire de sodium221. Dans des modèles murins, il a été montré que des modèles d’inactivation des gènes NPPA ou NPRA induisaient des hausses de pression d’environ 20 à 40 mmHg et une sensibilité pressive au sel plus importante222,223. Des modèles transgéniques murin avec une augmentation des concentrations circulant d’ANP entraînaient une diminution des pressions artérielles dans les mêmes proportions224.
NPRA et NPRB sont des récepteurs transmembranaires avec un domaine intracellulaire d’environ 570 AA avec une activité guanilyl cyclase et une activité tyrosine kinase. Ils ont 63%d’homologie entre eux.
Le NPRC présente un domaine raccourci (seulement 37 AA) et seulement 30% d’analogie. Il a une action d’internalisation des NPs en favorisant leur dégradation lysosomale. Il présente néanmoins une activité physiologique intracellulaire par son couplage aux protéines G inhibitrices ce qui entraîne via leur sous-unité α une inhibition de l’adenyl cyclase et via leurs sous-unités βγ une activation de la Phospholipase C (PLC).
Le potentiel thérapeutique a été transformé pour 2 médicaments que sont l’anaritide (CARPERITIDE®) qui est un analogue de l’ANP et le nesiritide (NATRECOR®) qui est du BNP recombinant approuvé par la FDA dans l’insuffisance cardiaque décompensée.
Les gènes des 3 ligands sont situés sur 2 chromosomes différents. NPPA et
NPPB, qui codent pour ANP et BNP respectivement, sont en 1p36.2 et NPPC,
Les gènes des récepteurs sont situés à différents loci NPR1 en 1q21-22, NPR2 en 9p21-p12 et NPR3 en 5p14-p1. Les 2 premiers ont des structures très proches avec un gène d’environ 16 kb et 22 exons. NPR3 ne contient que 8 exons.
Figure 29 Localisation des gènes du système des peptides natriurétiques (d’après Vassalle C Clin Chem 2009)
Un certain nombre de variants génétiques du système ont été associés avec des marqueurs de maladies cardiovasculaires ou métaboliques.
NPPA (ANP)
Plusieurs variants sont associés au risque de ND dans le DT1225,226, tandis qu’un RFLP de l’intron 1 ne l’est pas227. Dans une population générale de
mexicains, 2 RFLP sont associés à l’albuminurie228.
L’allèle C du rs5065 semble protecteur vis-à-vis du risque coronarien chez des patients Afro antillais DT2229.
Le polymorphisme TC2238 semble associé avec un risque augmenté d’AVC ischémique dans des populations japonaises230,231 tandis que le variant G664A ne semble pas conférer ce risque232.
Il a été montré qu’un variant situé dans le promoteur du NPPA (-A2843G) était associé aux concentrations plasmatiques d’ANP d’une part, mais également à l’hypertrophie ventriculaire gauche chez les patients hypertendus dans des populations italiennes233 et chinoises234.
NPPB (BNP)
Le variant T381C du NPPB est associé avec la concentration de NT-proBNP chez des DT1 sans être associé ni avec la ND ni avec la mortalité235. Ce variant a également été associé avec la concentration de BNP et le risque de DT2 chez des caucasiens236. Ce risque de survenue de diabète a été confirmé dans la méta-analyse de 49 279 sujets réalisée par Choquet et al.237.
Trois variants ont été associés avec les concentrations plasmatiques d’ANP et de BNP ainsi que la pression artérielle chez 17 773 patients caucasiens238 ce qui a été confirmé pour la pression artérielle dans la cohorte DESIR (pour Data from an Epidemiological Study on the Insulin Resistance Syndrome cohort)239. Ces travaux n’ont cependant pas permis de conclure à un effet sur la survenue de microalbuminurie ou la dégradation du DFGe.
NPR1
Les variants du gène NPRA ont été associés avec les concentrations plasmatiques de BNP et l’HTA d’une part240, le risque d’IDM241 mais également de remodelage ventriculaire myocardique chez les patients hypertendus233.
NPR2
Chez des japonais, le variant G2628A situé dans la région 3’ non traduite (ou 3’UTR pour 3’ untranslated region) est associé au risque d’HTA242. Des
données de Rahmutual et al. ont montré que le polymorphisme d’I/D de l’intron 18 n’était pas en faveur d’une association avec le risque d’HTA ou d’AVC243,244. NPR3
Dans les DT1, il a été montré par Roussel et al. qu’un variant de l’exon 8 était associé à la progression de la ND245.
L’allèle C du variant -55AC, situé dans le promoteur de NPR3, prédispose à des concentrations plus basses d’ANP, des chiffres tensionnels plus élevés246,247.
Ce même allèle a également été associé à la prédisposition familiale d’HTA248 tandis que l’allèle A était associé au risque d’obésité abdominale249.
Dans le GWAS mené par Estrada et al., il a été montré un signal fort d’association entre des variants proches du gène NPR3 (rs10472828) et la mesure de la taille250.
Il a par ailleurs été montré par Lanfear et al. qu’un variant situé dans l’exon 2 du
NPR3 était associé à la fonction ventriculaire gauche et interférait sur la relation
entre concentrations de BNP circulant et pression télédiastolique qui traduisent le niveau d’étirement myocardique251.