Etude des mTK gst mutées les plus performantes

2.4.1. Introduction

A l’issue du criblage des banques de mTKgst mutées vis-à-vis du L-glycéraldéhyde, quatre mutants de la banque obtenue par saturation de site sur les deux positions (banque SSM-L382D470) et quatre mutants de la banque obtenue par mutagenèse par cassette (banque CM) ont été sélectionnés. Leurs activités vis-à-vis du L-glycéraldéhyde et du D- glycéraldéhyde avaient été estimées à partir des lysats non purifiés.

Dans cette partie, les huit clones seront cultivés à plus grande échelle de manière à purifier les mTKgst mutées correspondantes. Leurs activités spécifiques vis-à-vis du L-glycéraldéhyde et du D-glycéraldéhyde seront déterminées par le test pH-métrique.

A l’issue de ces mesures la mTKgst la plus performante sera sélectionnée et plus finement étudiée. La thermostabilité de ce mutant sera vérifiée. Puis son activité vis-à-vis du L-glycéraldéhyde et du D- glycéraldéhyde sera étudiée en fonction de la température par dosage indirect du Li-HPA au cours du temps. Une synthèse à l’échelle préparative sera effectuée afin d’isoler et de caractériser le produit formé. Enfin, la structure de la mTKgst mutée la plus performante sera modélisée afin d’étudier les interactions entre les résidus mutés et les substrats accepteurs.

187

2.4.2. Obtention des mTK

mutées purifiées

Les quatre double-mutants issus de la banque SSM-L382D470, notés SSM1, SSM2, SSM3 et SSM4 et les quatre mutants issus de la banque CM, notés CM1, CM2, CM3 et CM4 sont présentés dans le tableau suivant :

mTKgst mutées Positions 380 381 382 383 384 469 470 471 472 473 séquence sauvage A D L A S E D G P T CM1 ^{A D L A T E H Q P T} CM2 A D L E T E T G T T CM3 S D L A C E N L P T CM4 A D L A S E T G P T SSM1 D T SSM2 N S SSM3 G S SSM4 D S

Tableau 29 : Huit mTKgst mutées sélectionnées à l’issue du criblage des banques SSM et CM

La souche d'expression BL21(DE3) d’E. coli a été transformée par les plasmides issus des huit clones sélectionnés afin de nous assurer que la variation d'activité observée est bien due au gène muté. Puis des cultures de 400 mL ont été réalisées et les mTKgst mutées ont été purifiées par chromatographie d’affinité d’ions métalliques (IMAC) sur une résine Ni-NTA (Tableau 30). TK ^Volume de culture Masse de cellules Protéines purifiées [mL] [g] [mg] mTKgst sauvage 1000 3,8 160 CM1 400 1,1 38,0 CM2 400 1,17 14,8 CM3 400 1,15 40,6 CM4 400 1,24 55,6 SSM1 400 1,52 77,8 SSM2 400 1,44 76,0 SSM3 400 1,23 74,4 SSM4 400 1,47 70,0

188

2.4.3. Détermination des activités spécifiques vis-à-vis du

-glycéraldéhyde

et du

-glycéraldéhyde

Les activités spécifiques des mTKgst mutées purifiées vis-à-vis du L-glycéraldéhyde et du D-glycéraldéhyde ont été déterminées grâce au test d’activité pH-métrique décrit page 156, en présence de 84 µM de rouge de phénol (Figure 114). Les résultats montrent que l’augmentation de l’activité vis-à-vis du L-glycéraldéhyde est modérée pour les mTKgst issues de la banque CM (environ 2 fois celle de la mTKgst sauvage) et plus importante pour les mTKgst mutées issues de la banque SSM, ce qui confirme les résultats obtenus précédemment avec les lysats.

En particulier, les doubles mutants SSM1 (L382D/D470T) et SSM4 (L382D/D470S) présentent les activités les plus élevées vis-à-vis du L-glycéraldéhyde c’est-à-dire environ 0,5 U/mg, soit 5 fois l’activité de la mTKgst sauvage.

Par ailleurs, les activités vis-à-vis du D-glycéraldéhyde de toutes les mTKgst mutées sont significativement réduites (d’un facteur 6 ou plus) par rapport à celle de l’enzyme sauvage.

Figure 114 : Activités spécifiques des mTKgst mutées purifiées vis-à-vis du L-glycéraldéhyde et du D-glycéraldéhyde

La figure encadrée est un agrandissement des activités obtenues en présence du L -glycéraldéhyde. Le milieu contient 84 µM de rouge de phénol, 2,4 mM de ThDP, 9 mM de MgCl2, 20 mM de D-ou de L-glycéraldéhyde, 50 mM de Li-HPA, 2 mM de tampon TEA pH 7,5 et mTKgst mutées purifiées : 20 - 50 µg ou mTKgst sauvage purifiée : 4 µg avec D -glycéraldéhyde ou 90 µg avec L-glycéraldéhyde). Volume total : 200 µL. L’absorbance est mesurée à 560 nm, à 28 °C. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 L-glycéraldéhyde D-glycéraldéhyde A c tiv ité (U/mg) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 L-glycéraldéhyde A c ti v it é ( U /m g)

189

Déter i atio du fa teur d’é a tioséle tivité E

Le paramètre permettant d’évaluer l’énantiosélectivité d’une enzyme est le facteur d’énantiosélectivité E. Nous avons vu précédemment qu’il était possible de calculer ce paramètre à partir des constantes cinétiques KM et Vmax de l’enzyme sauvage pour chacun des substrats (équation (6)). Pour la mTKgst de type sauvage, un ER de 90 avait été calculé en faveur de l’énantiomère D- ou (2R) du glycéraldéhyde. Il est toutefois possible de calculer un E estimé à partir des vitesses initiales des réactions pour l’un et l’autre des énantiomères (équation (7)).[152] Ce E estimé se rapproche d’autant plus du E réel que les concentrations en substrats sont inférieures à leurs KM.[152] Le facteur E de la mTKgst vis-à-vis du L-glycéraldéhyde (noté ES), calculé à partir des KM et Vmax est de 0,01. Le ES estimé calculé à

partir des vitesses initiales mesurées ici est alors de 0,03. Bien que le ES et le ES estimé diffèrent légèrement, ils sont du même ordre de grandeur, ce qui signifie que le ES estimé

peut être raisonnablement utilisé afin de comparer l’énantiosélectivité des mTKgst.

^⁄

⁄

Ainsi les ES estimés ont été calculées pour les huit mTKgst mutées à partir des vitesses initiales mesurées vis-à-vis du L-glycéraldéhyde et du D-glycéraldéhyde (Figure 115). Les résultats montrent que toutes les mTKgst mutées présentent un ES nettement supérieur à celui de la mTKgst sauvage. Il atteint la valeur de 1 au maximum soit aucune sélectivité entre les deux énantiomères. Néanmoins il a été augmenté d’un facteur 100 par rapport au ES de l’enzyme sauvage.

190

Figure 115 : Facteur d’énantiosélectivité ES estimé, pour les huit mTKgst et la mTKgst sauvage Le milieu contient 84 µM de rouge de phénol, 2,4 mM de ThDP, 9 mM de MgCl2, 20 mM de D- ou de L-glycéraldéhyde, 50 mM de Li-HPA, 2 mM de tampon TEA pH 7,5 et mTK_gst mutées purifiées : 20 - 50 µg ou mTK_gst sauvage purifiée : 4 µg (D-glycéraldéhyde) ou 90 µg (L-glycéraldéhyde). Volume total μ 200 µL. L’absorbance est mesurée à 560 nm, à 28