Construction d'un modèle moléculaire du mutant mTK gst - -L382D/D470S -L382D/D470S

Mg²⁺, ThDP + L-(2S)-glycéraldéhyde OH OH 4: L-érythro (3S,4S)-ribulose OH OH 50 °C

Figure 119 : Synthèse du l-ribulose catalysée par la mTKgst-L382D/D470S

Le suivi de la réaction par dosage du Li-HPA au cours du temps montre que celui-ci a été presque intégralement consommé au bout de 6 h (contre environ 24 h avec la mTKgst sauvage). Après purification sur gel de silice, un produit a été obtenu avec un rendement de 90 %. Les spectres de RMN ¹H et ¹³C confirment qu’il s’agit bien du L-ribulose.

2.4.4.4. Construction d'un modèle moléculaire du mutant mTKgst -L382D/D470S

Dans le but d’interpréter l’activité accrue du mutant mTKgst-L382D/D470S vis-à-vis du L-glycéraldéhyde par rapport à la mTKgst sauvage, mais également son activité quasiment indifférenciée pour les deux énantiomères L- et D-glycéraldéhyde, nous nous sommes intéressés aux interactions entre ces substrats et les résidus du site actif de la mTKgst mutée. Pour cela, un modèle du mutant mTKgst-L382D/D470S a été construit à partir du modèle précédemment obtenu pour la mTKgst sauvage. Dans ce nouveau modèle, le cofacteur est représenté sous sa forme DHE-ThDP (dihydroxyéthyle-ThDP), dans laquelle le C2 du cycle thiazolium est lié de façon covalente au groupe carbonyle du groupement « cétol » du substrat donneur. Le complexe DHE-ThDP sous forme carbanion est alors prêt à réagir avec le substrat accepteur (Figure 120).

196 N⁺ S N N NH₂ R' CH₂OH R₁ O _H ^{N NH} His 481 ThDP Substrat donneur a) CH₂OH OH N⁺ S R' R NH HN 263 His H O OH CH₂OH CH₂OH OH S R' R Complexe DHE-ThDP forme énamine forme carbanion substrat accepteur L- ou D-glycéraldéhyde b)

Figure 120 : Formation du complexe DHE-ThDP

a) Réaction entre le substrat donneur et le ThDP ; b) Complexe DHE-ThDP

Ensuite, les deux substrats L- et D-glycéraldéhyde ont été respectivement ajoutés à la structure et placés de manière à ce que leur position soit favorable à la réaction de transfert du groupement cétol sur le carbone électrophile de l’aldéhyde (C1) du substrat, c’est-à-dire dans une position telle que l’oxygène de la fonction aldéhyde soit stabilisé par les His263 et His28. Les deux nouvelles structures obtenues, d’une part avec le L-glycéraldéhyde et d’autre part avec le D-glycéraldéhyde, ont ensuite été traitées à l’aide du logiciel Sybyl 2.1 afin de réaliser une minimisation d’énergie. Les résultats montrent que les deux mutations (L382D et D470S) apportées à mTKgst n'entraineraient pas de modification de la structure tertiaire du site actif (Figure 121).

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Figure 121 : Modèle du site actif de la mTKgst-L382D/D470S en présence des substrats accepteurs

a) En présence du L-glycéraldéhyde ; b) en présence du D-glycéraldéhyde

Dans la structure de la mTKgst sauvage, la présence du résidu hydrophobe Leu382 aurait pour rôle de « repousser » les substrats porteurs de fonction hydroxyles (hydrophiles) vers la partie du site actif occupée par l’Asp470. Comme nous l’avons vu précédemment, seuls les aldéhydes α-hydroxylés de configuration (2R) peuvent alors établir une interaction directe avec l’Asp470 et ainsi être positionnés de façon favorable à la réaction de transfert du groupement « cétol » sur la face re de la fonction aldéhyde. Ceci explique l’énantiosélectivité des TK de type sauvage en faveur des aldéhydes α-hydroxylés de configuration de (2R). Dans le cas de la mTKgst mutée étudiée présentant les mutations L382D et D470S, une interaction directe serait possible entre l’hydroxyle en C2 de configuration (S) du substrat L-glycéraldéhyde et l’Asp en position 382, tout en autorisant une position favorable de cet aldéhyde pour la réaction de transfert du « cétol » (Figure 121a). De plus, l’hydroxyle en C3 du substrat est stabilisé grâce à une interaction possible avec la Ser en position 470 via une molécule d’eau. Ces considérations permettraient donc d’interpréter l’activité de la mTKgst -L382D/D470S vis-à-vis du L-glycéraldéhyde plus importante que celle obtenue avec l’enzyme sauvage.

Par ailleurs, les interactions entre le site actif de cette mTKgst mutée et le D-glycéraldéhyde ont également été étudiées à l’aide de ce modèle. Dans ce cas, la Ser en position 470 est beaucoup moins favorable par rapport à l’Asp pour établir une interaction hydrogène directe avec le groupement hydroxyle du C2(R). Cependant une interaction indirecte via une molécule d’eau serait envisageable entre ce groupement hydroxyle et la Ser470. Cette observation permettrait donc d’expliquer la plus faible activité du mutant par rapport à

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l’enzyme sauvage vis-à-vis de l’énantiomère D. Une autre interaction parait envisageable entre le groupement hydroxyle en C3 du D-glycéraldéhyde et l’Asp en position 382. Ces deux mutations n’entraînent pas de changement quant au positionnement du C1 de la fonction aldéhyde de l’accepteur par rapport au DHE-ThDP et ainsi la réaction de transfert serait toujours stériquement possible, mais avec une moindre efficacité par rapport à l’enzyme sauvage, comme le montrent les résultats expérimentaux (Figure 121b).

Ainsi, ce modèle permet de formuler des hypothèses expliquant l’activité quasiment indifférenciée de la mTKgst-L382D/D470S vis-à-vis des deux énantiomères du glycéraldéhyde, puisque le même nombre et le même type d’interactions sont observées entre l’enzyme et les deux substrats.

Remarque : des interprétations similaires peuvent être formulées avec une Thr en position 470 à la place de la Ser. En effet, ces deux résidus portent une fonction hydroxyle dont la position par rapport au substrat est similaire. Ceci expliquerait que le mutant mTKgst -L382D/D470T (SSM1) présente des activités vis-à-vis du L- et D-glycéraldéhyde comparables à celles de la mTKgst-L382D/D470S.

2.4.5. Conclusion

L’étude des mTKgst mutées purifiées ont permis de confirmer les résultats précédemment obtenus à partir des lysats. Les doubles mutants de la banque SSM présentent des activités plus élevées que les mutants sélectionnés à partir de la banque CM. La mTKgst la plus performante porte les mutations L382D/D470S. Elle présente environ 5 fois plus d’activité vis-à-vis du L-glycéraldéhyde que la mTKgstet une diminution d’un facteur 6 par rapport au D-glycéraldéhyde. Ceci se traduit par une augmentation du facteur d’énantiosélectivité ES

d’environ 100 (ES d’environ 1 pour le mutant contre environ 0,01 pour l’enzyme sauvage). Cependant, l’énantiosélectivité n’a pas été inversée (E de 1). La thermostabilité à 65°C de ce mutant a été confirmée. Puis l’étude des activités en fonction de la température a montré que celles-ci sont nettement améliorées à 20 °C par rapport à 50°C. Une activité de 4,9 U/mg vis-à-vis du L-glycéraldéhyde à 50°C a été obtenue avec la mTKgst-L382D/D470S contre 1,3 U/mg avec la mTKgst à la même température. Une synthèse à échelle préparative en présence de Li-HPA, de L-glycéraldéhyde et de ce mutant a permis de confirmer par RMN que le L-ribulose était effectivement formé.

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Enfin, un modèle de la structure tridimensionnelle du site actif de la mTKgst-L382D/D470S a été construit afin d’expliquer l’amélioration de l’activité du L-glycéraldéhyde par rapport à l’enzyme sauvage et la diminution de celle-ci avec l’énantiomère D. L’hydroxyle en C2 (S) du L-glycéraldéhyde accepteur pourrait établir une liaison hydrogène directe avec l’Asp en position 382 de la mTKgstmutée, de façon similaire à celle existante entre l’hydroxyle en C2 (R) de l’accepteur et l’Asp 470 chez la mTKgst sauvage. La Ser en position 470 permettrait quant à elle de stabiliser l’hydroxyle en C3 de l’accepteur. Par ailleurs, les plus faibles activités obtenues avec l’énantiomère D pourraient s’expliquer par l’interaction indirecte de l’hydroxyle du C2 (R) avec la ser380 via une molécule d’eau. Ces mutations maintiendraient le D-glycéraldéhyde dans une position qui reste favorable au transfert du groupement « cétol » sur la fonction aldéhyde mais avec une moindre efficacité que l’enzyme sauvage.

En conclusion, ces travaux ont permis de faire émerger dès le premier cycle de mutagenèse une mTKgst mutée qui présente une amélioration de l’activité vis-à-vis d’un aldéhyde -hydroxylé de configuration (2S). Ce mutant présente conjointement une diminution de l’activité vis-à-vis de la configuration (2R) ce qui constitue une première étape significative vers l’inversion de l’énantiosélectivité de l’enzyme. La banque SSM nous a permis de comprendre l’influence des mutations identifiées comme les plus favorables sur l’énantiosélectivité. Les travaux décrits dans la littérature concernant l’inversion de l’énantiosélectivité d’enzymes [162, 179] montrent que plusieurs cycles de mutagenèse/criblage sont nécessaires afin d’obtenir une enzyme optimisée. Cette stratégie sera envisagée pour la suite de nos travaux, à partir des mTKgst les plus performantes obtenues à ce stade. L’effet coopératif de nouvelles mutations sur d’autres positions pourrait être envisagées selon une approche dirigée ou encore semi-aléatoire sur des séquences plus larges en utilisant la technique de mutagenèse par cassette mais cette fois « en fixant » les résidus identifiés comme étant les plus favorables c'est-à-dire D382 et S ouT470.