Amélioration de l’activité de la TK pour des substrats accepteurs non- naturels

Mutagenèse par saturation de site sur un gène entier (« GSSM »)

3.5. Amélioration et modification des propriétés de la TK

3.5.2.3. Amélioration de l’activité de la TK pour des substrats accepteurs non- naturels

Afin d’élargir le spectre d’activité de la TK, les équipes des Pr. P. Dalby et H. Hailes ont étudié l’activité des TK mutées vis-à-vis de différents accepteurs: principalement des aldéhydes non-α-hydroxylés aliphatiques[31, 125-127] et des aldéhydes aromatiques.[128, 129] Par ailleurs, une étude publiée en 2008 sur la stéréosélectivité de la TK sur le C3 de l’α,α’-dihydroxycétone formée a montré que si cette stéréosélectivité est excellente avec le glycolaldéhyde comme accepteur ( ee > 95 % en faveur du produit de configuration 3S), elle est beaucoup moins élevée en présence d’un aldéhyde non-α-hydroxylé tel que le propanal (ee : 58 % en faveur du produit de configuration 3S). Cette constatation a été le point de départ d’une étude portant sur la recherche de TK mutées présentant une meilleure stéréosélectivité.

Pour mettre en évidence les TK mutées d’intérêt, différents tests de criblage spectrophotométriques ou chromatographiques ont été choisis en fonction des produits formés et des propriétés recherchées (activité ou stéréospécificité) (Tableau 5). Les différents aldéhydes accepteurs sont toujours mis en présence du donneur Li-HPA.

Une première étude portant sur l’activité des TK mutées vis-à-vis d’un substrat non-phosphorylé, le glycolaldéhyde, a montré que les mutations des résidus choisis selon un critère phylogénétique n’influencent que modérément l’activité enzymatique tandis que les mutations de résidus structuralement proches du substrat ont permis d’augmenter l’activité de façon plus importante, comme par exemple les mutations H461S et R520V qui ont permis d’augmenter l’activité d’un facteur 4,8 et 3,6 respectivement (Tableau 5).[31] Il est à noter que ces résidu ont un rôle dans la fixation des groupements phosphates ce qui peut expliquer l’effet bénéfique de ces mutations dans ce cas.

Puis une seconde étude a permis de mettre en évidence des mutations permettant d’améliorer l’activité vis-à-vis d’un substrat non α-hydroxylé, le propanal. Les mutations les plus favorables sont, entre autres R520V (4,7), D469T (4,9) et D469A (4,3). La sélectivité de l’enzyme vis-à-vis des deux substrats accepteurs, glycolaldéhyde et propanal, a également été étudiée : la mutation D469Y permet une augmentation de la sélectivité de la TK en faveur du propanal de 64 fois par rapport à celle observée avec la TK d’E. coli de type sauvage. Or l’intéraction du résidu Asp469 avec l’hydroxyle en C2 des accepteurs ayant déjà été décrite,[42] sa mutation parait cohérente. D’autre part, une deuxième génération de

double et triple mutants a été construite selon la méthode « CASTing » en combinant les positions mutées favorablement.[130] Ainsi les doubles mutants D469Y/R520V et D469T/R520Q ont été sélectionnés pour une activité relative de 9,6 et 7,7 vis-à-vis du propanal par rapport la TK sauvage mettant en évidence l’effet de coopération entre plusieurs mutations. Par ailleurs, la stéréochimie des produits obtenus a été étudiée. Les expériences en présence du propanal ont montré qu’il était non seulement possible d’augmenter la stéréosélectivité d’un ee de 58 % en faveur du produit (3S) pour la TK sauvage à un ee de 90 % pour le mutant D469E mais également d’inverser cette stéréosélectivité puisque qu’un ee de 88 % en faveur du produit (3R) a été obtenu pour le mutant H26Y. (Tableau 5).

R O TK mutées R HO O HO COOLi O Li-HPA LiHCO₃ + Mg₂⁺, TPP + OH Amélioration ou Inversion de la stéreospécificité en C3 Augmentation de l'activité pour l'aldéhyde

Propriété recherchée Méthode de criblage Mutant Résultats Ref.

Amélioration de l’activité avec le glycolaldéhyde

Dosage du produit (erythrulose) par HPLC

H461S ^{Activité améliorée d'un facteur 4,8 par rapport}

à la TK-wt

[31]

A29E ^{Activité améliorée d'un facteur 3 par rapport à}

la TK-wt

Amélioration de l’activité avec le propanal

1) Suivi CCM et Test au tetrazolium red

2) dosage du produit par HPLC

D469T ^{Activité améliorée d'un facteur 4,9 par rapport}

à la TK-wt ^[125]

D469Y

Spécificité propanal/glycolaldéhyde augmentée d'un facteur 64 par rapport à la TK-wt

[125]

D469Y/R520V ^{Activité améliorée d'un facteur 9,6 par rapport}

à la TK-wt ^[130] Amélioration de la stéréosélectivité HPLC chirale ou GC chirale D469E _{90 % ee (3S) ; TK-wt: 58% ee (3S)}

(sur le produit issu du propanal)

[127] Inversion de la

stéréosélectivité ^H26Y ^{88 % ee (3R)}

Amélioration de l’activité avec des aldéhydes aliphatiques (C4-C8)

HPLC ou RMN (ester de

Mosher) ^D469E Rendements et ee supérieurs à TK-wt ^[126]

Amélioration de l’activité

avec des aldéhydes aromatiques

1) Test au rouge de tétrazolium

2) Pouvoir rotatoire, HPLC et RMN

F343A ^{10% rendement avec le benzaldéhyde}

(TK-wt : 0%) ^[128]

Tableau 5 : Mutants de TK ayant des propriétés modifiées ou améliorées par rapport à la TK d’E. coli de type sauvage (TK-wt)

Enfin, les meilleurs TK mutées sur une seule position obtenues précédemment (D469E, D469T et H26Y) ainsi que le mutant F434A (adjacent au D469) ont été étudiées en présence

d’aldéhydes accepteurs hydrophobes aliphatiques,[126] cycliques,[126] aromatiques [128] et hétéroaromatiques(Figure 37).[128] Quelques mutants ont montré une activité accrue pour les aldéhydes aliphatiques C3 à C8 et les aldéhydes cycliques C4 à C7. Pour les aromatiques et hétéroaromatiques, de faibles taux de conversion ont généralement été mesurés (<5%).

Figure 37 : Amélioration de l’activité de TK d’E.coli vis-à-vis de substrats accepteurs aliphatiques et aromatiques

Schéma extrait de la littérature [131]

Plus récemment, un autre groupe, celui du Pr. U. Hanefeld (Pays-Bas) s’est intéressé à l’amélioration de la TK de S. cerevisiae par évolution dirigée.[132] L’étude a été centrée sur l’amélioration de l’activité de cette TK vis-à-vis des aldéhydes accepteurs non-phosphorylés, présentant de longues chaines polyhydroxylées : le D-ribose et le D-glucose. Une banque a été construite par saturation de site en ciblant individuellement cinq résidus conservés : H30, H263, D477, H481 et R528. La banque a été criblée en deux étapes à l’aide de méthodes

basées sur l’HPLC puis la GC.[119] L’activité vis-à-vis du D-ribose et du D-glucose ont pu être améliorées jusqu’à un facteur 2 par rapport à la TK de S. cerevisiae sauvage, notamment grâce à des mutations sur la position R528N. Puis une seconde génération de doubles mutants a été construite à partir des mutations les plus favorables et a conduit aux mutants R528Q/S527T et R258K/S527T dont les activités relatives par rapport à la TK sauvage ont été augmentées d’un facteur 3,7 et 2,5. Ces travaux mettent ainsi en évidence l’interêt des stratégies basées sur des mutations multiples grâce à l’effet de coopération entre les mutations.[131]

3.5.2.4. Conclusion

Ces premiers travaux de modification des propriétés de la TK par mutagenèse selon une approche rationnelle ont permis d’augmenter l’activité de la TK vis-à-vis de certains substrats, d’élargir son spectre de substrats accepteurs de la TK ainsi que d’augmenter et voire même d’inverser la stéréospécificité au niveau du carbone 3 du cétose formé. Ces résultats pourront conduire, d’une part, à de nouvelles applications en synthèse, mais également, à des études plus fondamentales afin de mieux comprendre les relations structure-fonction de la TK.

Dans le document Etude de la transcétolase de Geobacillus stearothermophilus et modification de son énantiosélectivité par ingénierie enzymatique (Page 73-78)