La courbe de calibration de l’absorbance à 560 nm en fonction de la concentration en ions HCO3- a été déterminée en présence de 84 µM de rouge de phénol (Figure 95). Le milieu contient tous les réactifs du test sauf le Li-HPA, et différentes concentrations en NaHCO3 allant de 0 à 0,8 mM afin de mimer une faible conversion du Li-HPA par la mTKgst en vitesse initiale.
Figure 95 : Courbe de calibration en présence de NaHCO3
Le milieu contient 84 µM de rouge de phénol, 14 µg de mTKgst purifiée, 2,4 mM de ThDP, 9 mM de MgCl2, 50 mM de Li-HPA, 2 mM de tampon TEA et 0 – 0,8 mM de NaHCO3. Volume total : 200 µL
Cette droite de calibration est linéaire sur la gamme de concentrations étudiée et présente une pente de 0,3448 UA.mM-1, soit une sensibilité environ trois fois supérieure à celle obtenue en présence de 28 µM de rouge de phénol.
La régression linéaire effectuée sur cette droite conduit à une LOD de 0,04 mM et une LOQ de 0,12 mM d’ions HCO3-, correspondant à des variations d’absorbance de 0,014 UA et 0,041 UA respectivement. Cette droite de calibration permet de calculer l’activité enzymatique à partir de la pente donnée par le suivi de l’absorbance à 560 nm au cours du temps grâce à l’équation suivante :
(4) y = 0,3448x + 0,4233 R² = 0,9906 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 A560 [HCO3-] (mM)
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Calibration en fonction de la quantité de TK
La linéarité du test a ensuite été vérifiée en mesurant l’activité enzymatique en fonction de la quantité d’enzyme. Différentes quantités de mTKgst purifiée (de 0 à 10 µg) ont été mises en présence de 20 mM de D-glycéraldéhyde, dans les conditions du test (Tableau 20). Les pentes (UA.min-1) ont été mesurées pour chacune des quantités en mTKgst (Figure 96a) et l’équation Erreur ! Source du renvoi introuvable. a été utilisée pour convertir ces pentes n activité (U) (Figure 96b).
Figure 96 : Courbe de calibration en fonction de la quantité de mTKgst
Le milieu contient 84 µM de rouge de phénol, 2,4 mM de ThDP, 9 mM de MgCl2, 20 mM de D-glycéraldéhyde, 50 mM de Li-HPA, 2 mM de tampon TEA pH 7,5 et 0 – 10 µg de mTKgst purifiée. Volume total : 200 µL. a) Pentes des absorbances au cours du temps en fonction de la quantité de mTKgst ; b) Activités en fonction de la quantité de mTKgst, calculées à partir des pentes (a)
L’activité enzymatique est linéaire entre 0 et 8 µg de mTKgst. La régression linéaire effectuée sur ce domaine a permis de calculer une LOD de 1,7 mU (correspondant à une pente de 0,003 UA/min) et une LOQ de 5,2 mU (correspondant à une pente de 0,009 UA/min). Cela signifie que l’activité minimale qui pourra être mesurée dans un puits est de 5,2 mU, ce qui est une amélioration par rapport aux conditions initiales du test pour lesquelles l’activité minimale était de 14,1 mU. Par ailleurs, l’absorbance n’est plus linéaire au-dessus de 26 mU (soit une pente de 0,045 UA/min). En d’autres termes, l’étendue de mesure de ce test est de 5,2 mU à 26 mU. y = 0,0036x - 0,0013 R² = 0,9931 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A ct iv it é (U ) mTKgst(µg) y = 0,0063x - 0,0023 R² = 0,9931 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P ent e (UA .min -1) mTKgst(µg) a) b)
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2.2.6. Conclusion
Un test d’activité pH-métrique en présence de rouge de phénol a été mis au point, permettant la détermination quantitative de l’activité de la transcétolase en présence de Li-HPA comme substrat donneur vis-à-vis de différents substrats accepteurs. La fiabilité du test est attestée par les valeurs des constantes cinétiques obtenues équivalentes à celles indiquées dans la littérature. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication dans
ChemBioChem donnée en annexe du manuscrit.[151]
L’utilisation de ce test en présence de lysats cellulaires et d’un mauvais substrat, le L-glycéraldéhyde, a nécessité des expériences supplémentaires afin d’améliorer sa sensibilité. Notamment, la concentration en indicateur pH-métrique, la durée de la mesure et la variation de l’absorbance (par diminution du pH initial) ont été augmentées. Les conditions du test pH-métrique ont été optimisées d’une part pour le criblage haut-débit d’un grand nombre de clones, de façon qualitative afin d’identifier rapidement les mTKgst mutées les plus actives, et d’autre part pour la mesure quantitative des activités des mTKgst purifiées identifiées à l’issue du criblage.
Ce nouveau test d’activité pH-métrique de la TK présente de nombreux avantages par rapport aux tests décrits jusqu’ici. Bien qu’il soit moins sensible que les tests en présence de NADH et que son étendue de mesure soit réduite (de 5 à 26 mU), il est direct, rapide, quantitatif, et convient à tout type d’aldéhyde accepteurs. Il est de surcroît facile à mettre en œuvre, miniaturisable en microplaques λ6-puits et peu coûteux. Ce test bénéficie donc de tous les critères requis pour le criblage à haut débit aussi bien d’un grand nombre de substrats vis-à-vis d’une TK donnée (appelé « Fingerprinting» [178]) que d’un grand nombre de TK mutées vis-à-vis d’un substrat donné. Un verrou technologique est donc levé car jusqu’alors il n’existait aucune méthode automatisable et générique permettant de déterminer l’activité de la TK de façon qualitative ou quantitative.
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2.3. Criblage des mTK
gstmutées vis-à-vis d’un aldéhyde
α-hydroxylé de configuration (2S)
2.3.1. Introduction
Les trois banques obtenues par saturation de site (SSM), dont deux sur une position unique (SSM-L380 et SSS-D470) et une sur les deux positions simultanées (SSM-L382D470) ainsi que la banque obtenue par mutagenèse par cassette (CM) seront criblées afin de rechercher une ou plusieurs mTKgst mutée(s) présentant une activité vis-à-vis des aldéhydes α-hydroxylé de configuration (2S). Pour cela, le L-(2S) glycéraldéhyde a été choisi comme substrat modèle car comme nous l’avons vu précédemment dans le chapitre « Production et
caractérisation d’une nouvelle TK thermostable », la mTKgst de type sauvage présente une légère activité vis-à-vis de ce substrat à température ambiante. Il s’agit donc ici d’amplifier cette activité qui sera alors considérée comme référence lors du criblage (borne basse) (Figure 97). La mTKgst sauvage présente par ailleurs une très bonne activité vis-à-vis de l’énantiomère D (2S) du glycéraldéhyde, ce qui constituera un contrôle positif lors du criblage. Le choix de ce substrat est conforté par le fait que les deux énantiomères L et D sont commerciaux. O mTKgst mutée HO O OH HO COOLi O Li-HPA LiHCO3 + Mg2+, ThDP + L-glycéraldéhyde OH OH L-ribulose OH OH (S) t.a.
Figure 97 : Réaction utilisée pour le criblage des mTKgst mutées en présence du Li-HPA comme donneur et du L-glycéraldéhyde comme accepteur
Les lysats contenant les mTKgst mutées les plus actives vis-à-vis du L-glycéraldéhyde seront sélectionnées. Puis, afin d’éliminer d’éventuels faux positifs, les clones correspondants seront de nouveau soumis à un cycle de culture et de criblage. Les activités des lysats obtenus seront mesurées vis-à-vis du L-glycéraldéhyde et du D-glycéraldéhyde. Enfin, les gènes codant pour ces mTKgst mutées seront séquencés.
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