Clonage et Surexpression

Les gènes codant pour les TK sauvages de G. stearothermophilus et G. thermodenitrificans ont été amplifiés par PCR puis clonés dans le vecteur d’expression pGEN452 dérivé de pET47b (voir la partie expérimentale). Ainsi, l'expression des gènes clonés est sous contrôle

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du promoteur T7, permettant la production de la TK en grande quantité. De plus, les TK ont été exprimées avec une étiquette de six histidines (6-His) située aux extrémités N-terminales des enzymes afin de faciliter leur purification par chromatographie d’affinité.

Par ailleurs, dans l’optique de réaliser par la suite des expériences de mutagenèse par cassette, le gène sauvage de TKgst (qui sera sélectionné pour la suite du projet) a été modifié de manière à supprimer certains sites de restriction et en ajouter de nouveaux aux positions choisies, qui permettront d’introduire les mutations aux positions choisies. Cette opération a conduit au changement de trois acides aminés dans la protéine : Leu397Phe, Asp399Gly et His479Gln. Ces résidus étant situés loin du site actif, ils ne devraient a priori pas avoir d’influence sur l’activité enzymatique. Le nouveau gène a été commandé à l’entreprise DSMZ qui en a réalisé la synthèse, puis il a été cloné dans le vecteur d’expression pGEN452, conduisant à une nouvelle TK modifiée de G. stearothermophilus (mTKgst).

Après transformation des gènes dans la souche d’E. coli BL21DE3, les cellules exprimant les TK sont cultivées dans notre laboratoire dans un milieu approprié (voir partie expérimentale) puis recueillies par centrifugation. Elles sont ensuite lysées par sonication à 4°C en présence de tampon. La suspension résultante est centrifugée et le surnageant, correspondant à l’extrait cellulaire soluble (aussi appelé CFE pour « cell free extract ») et contenant l’enzyme surexprimée est recueilli pour être purifié.

1.2.2.3. Purification

Les purifications des TKgth, TKgst et mTKgst exprimées avec une étiquette 6-His à leur extrémité N-terminale, ont été réalisées par chromatographie d’affinité en présence de cations métalliques (IMAC) (Figure 41a). L’extrait cellulaire soluble est déposé sur une colonne contenant une résine chargée en ions Ni²⁺, chélatés par l’acide nitriloacétique (résine Ni-NTA). La TK se fixe alors sur la résine par liaison de coordination entre l’étiquette 6-His et les cations Ni²⁺ tandis que les autres protéines ne sont pas retenues (Figure 41b). Enfin, la TK est éluée après ajout d’une solution d'imidazole à forte concentration qui permet de déplacer l’équilibre par compétition de ligands. Des études préalables ayant montré que les TKsce et TKeco précipitent en présence prolongée d’imidazole, une étape de dialyse est systématiquement réalisée après la purification, afin de recueillir la TK purifiée sans imidazole.

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Figure 41 : Purification de la TK par IMAC

a) Principe de la purification ; b) Interaction entre l’étiquette 6-Hist et la matrice Ni-NTA Schémas extraits du manuel « The QIAexpressionist^TM » de la société Qiagen et adaptés à la purification de la TK

La surexpression des TKgth, TKgst et mTKgst et la pureté des extraits purifiés ont été vérifiées par électrophorèses sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (Figure 42). L’électrophorégramme présente une bande unique à environ 74 kDa correspondant au poids moléculaire d’un monomère de TK. La masse d’un monomère de chaque TK a en effet été calculée à partir de la séquence protéique. Elle est de 73,63 kDa (682 résidus) pour la TKgth, de 71,94 kDa (668 résidus) pour la TKgst et 71,91 kDa pour la mTKgst (668 résidus). La TKeco traitée dans les mêmes conditions conduit à un profil similaire, avec une masse de 72,21 kDa. Dialyse (Elimination de l’imidazole) Accrochage de la TK Elution (tampon imidazole) Lyse des cellules (sonication) Lavage TK purifiée Résine Ni-NTA Extrait cellulaire brut a) b)

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Figure 42 : Analyses de la pureté et de la surexpression des TK par d’électrophorèse en conditions dénaturantes

a) 1 : Precision Plus protein^TM Allblue Standards ; 2 : TKeco purifiée ; 3 : TKgth CFE ; 4 :TK_gth purifiée ; 5 :TK_gst CFE ; 6 :TK_gst purifiée ; b) 1 : SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard ; 2 : mTKgst CFE ; 3 : mTKgst purifiée

L’activité enzymatique a été évaluée par un test spectrophotométrique direct, en présence du L-érythrulose, substrat donneur, du D-R5P, substrat accepteur, et des cofacteurs ThDP et Mg²⁺ (Figure 43). Le glycolaldéhyde formé au cours de la réaction est réduit en présence d’une enzyme auxiliaire, l’alcool déshydrogénase (ADH) et du cofacteur NADH. La consommation du NADH au cours du temps est suivie par mesure de son absorbance à 340 nm. Une unité de TK (U) correspond à une micromole de glycolaldéhyde (ou de substrat converti) par minute (µmol.min^-1). Ce test d’activité est réalisé à température ambiante et sera référencé par la suite sous le nom de « testNADH».

HO O OH OH NAD⁺ NADH + H⁺ HO ^OH H ^OH O + + L-érythrulose TK ThDP, MgCl₂ ADH suivi à 340 nm D-R5P D-S7P O _OPO3 2-OH OH OH OPO₃ 2-OH OH OH OH O HO

Figure 43 : Test d’activité de la TK : « testNADH »

Dans un test type, le milieu contient : la TK à tester, 9 mM de D-ribose-5P, 85 mM de L -érythrulose, 2,4 mM de ThDP, 9 mM de MgCl2, 0,28 mM de NADH, 25 U/mL d’ADH, 0,1 M de tampon Gly-gly; pH 7,5. 1 2 3 a) b) 250 kDa 75 kDa 37 kDa 98 kDa 75 kDa 1 2 3 4 5 6

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Les activités enzymatiques des différentes TK ont ainsi été mesurées, avant et après purification et les rendements de la purification ont été calculés pour un litre de culture cellulaire (Tableau 7). Les concentrations en protéines (mg.mL^-1) ont été déterminées par le test de Bradford.[143]

TK Fraction Activité Protéines ^Activité

spécifique ^Rendement [U] [mg] [U/mg] [%] TKgth ^{CFE 160 720 0,22} Purifiée _{55 181 0,30 34} TKgst ^{CFE 110,5 400 0,28} Purifiée _{60,5 131 0,46 55} mTKgst ^{CFE 174 580 0,30} Purifiée _{48,3 104 0,46 28}

Tableau 7 : Activités des TK avant et après purification par IMAC à 18°C Données pour 1 L de culture cellulaire (soit 3,8 g.L^-1 de cellules humides). Les activités sont mesurées dans les conditions types du test_NADH à 25°C.

Les TKgst purifiées présentent des activités spécifiques légèrement supérieures à celles de la TKgth. Globalement les activités spécifiques obtenues sont faibles car elles ont été déterminées à 18°C, température ambiante. La suite de l’étude montrera que, comme attendu, ces enzymes étant issues de microorganismes thermophiles, leur activité augmentent avec la température. Il est à souligner que l’activité spécifique de la mTKgst modifiée est identique à celle de la TKgst sauvage ce qui confirme que les trois résidus modifiés de la mTKgst n’ont pas d’incidence sur l’activité enzymatique.

Selon cette procédure de purification, environ 181 mg de TKgth, 131 mg de TKgst et 104 mg de mTKgst purifiées ont été obtenues à partir de 1 L de cultures respectives, contenant environ 3,8 g de cellules. A titre de comparaison, 1 L de culture conduit à 5,4 g de cellules et 425 mg de protéines purifiées dans le cas de la TKeco et à 4 g de cellules et 60 mg de protéines purifiées dans le cas de la TKsce. Après purification, les TKgth, TKgst et mTKgst peuvent être lyophilisées et conservées à 4°C pendant plusieurs mois sans perte d’activité.