Etude de la régénération des plantes transgéniques OsSHR1

Nous avons reproduit les lignées transgéniques OE SHR1, TALEN OsSHR1 et pSHR1:SHR1:GFP que nous avons transformées dans des cals pSHR1:GUS. Cette expérience a été réalisée dans le but de comprendre les problèmes de régénération rencontrés précédemment. Si l’introduction du transgène (TALEN, surexpresseurs,…) modifie le niveau d’expression d’OsSHR1 dans le cal, et si le gène est capable d’auto-activation pendant les étapes de callogénèse, alors nous nous attendons à observer cette modification d’expression grâce au profil GUS du gène dans le cal. Dans ce cas nous nous attendons à observer une réduction du signal GUS dans la lignée TALEN-SHR1 et une augmentation dans les lignées OE SHR1 et pSHR1:SHR1:GFP. Cependant, nous avons déjà démontré qu’il n’y avait pas d’autorégulation dans la plante des gènes OsSHR1 et OsSHR2 grâce à l’étude du niveau d’expression des gènes endogènes dans les lignées surexpresseurs. Il est néanmoins possible que des mécanismes de régulation du gène diffèrent pendant la callogénèse.

Le suivi du verdissement des cals transformés a mis en évidence un retard de régénération des cals dans le fond pSHR1:GUS. Ces derniers régénèrent 3 semaines plus tard que les mêmes construits transformés dans Nipponbare (Figure 14 a). Après 5 semaines (35 jours) de régénération, seulement 20% des cals pSHR1:SHR1:GFP dans le fond pSHR1:GUS présentent des structures chlorophylliennes alors que 80% des cals du même construit dans Nipponbare sont verts. Cette même tendance est observée pour les construits TALEN SHR1. Seul le construit OE SHR1 semble montrer une meilleure aptitude à la régénération (Figure 14 b). Le retard de régénération a posé problème puisqu’après 8 semaines (56 jours) passées sur le milieu de régénération, les cals ont commencé progressivement à prendre une couleur ocre puis à mourir. Nous n’avons donc pas pu analyser le profil d’expression d’OsSHR1 au stade d’émergence des plantules. Avant la mort des cals nous avons observé un blocage des cals TALEN-SHR1 au cours de la callogénèse, comme il avait été observé lors de la transformation de ces construits (Chapitre 2.III.2). Quant aux cals OE SHR1, nous avons de nouveau remarqué un blocage après le stade verdissement avec seulement 30 % des cals qui ont régénéré en plantules dans le fond pSHR1:GUS et 32 % dans le fond NB (contre 27.9% observés lors de la transformation génétique dans Nipponbare) (Figure 15).

Les profils GUS dans les cals des différents construits ont été suivis pendant 6 semaines consécutives et comparés à ceux observés chez les cals pSHR1:GUS (Figure 16). Pour chacun des construits nous avons bien observé un signal au centre du cal lors de la première semaine de régénération, suivi d’une diffusion progressive vers l’extérieur des cals. Contrairement à la localisation du transcrit SHR1 qui était stable entre les construits, l’intensité du signal était très variable d’un cal à l’autre. Nous nous sommes donc intéressés à la localisation du signal et non à son intensité. Après 7 semaines (50 jours de régénération), seul le construit OE SHR1 a pu être analysé au stade d’émergence des tiges, pour lequel nous avons relevé un profil GUS semblable à celui observé chez la lignée pSHR1:GUS. En effet, le signal a disparu du cal pour se concentrer dans les parties émergentes.

170 Figure 15 : L’émergence des organes est ralentie chez les cals transgéniques du fond pSHR1:GUS.

pSHR1:SHR1:GFP dans fond Nipponbare (n=14), dans fond pSHR1:GUS (n=35) ; TALEN SHR1 dans fond Nipponbare (n=4), dans fond pSHR1:GUS (n=14) ; OE SHR1 dans fond Nipponbare (n=7), dans fond pSHR1:GUS (n=21).

Graphique illustrant le pourcentage des cals présentant des ébauches d’organes (tiges et racine) pour chacun des construits pendant les 6 premières semaines de régénération. Les cals du fond pSHR1:GUS montrent un ralentissement dans la régénération, d’autant plus fort pour la lignée TALEN SHR1.

Figure 16 : Localisation du transcrit SHR1 pendant les étapes de régénération des lignées transgéniques SHR1 dans le fond pSHR1:GUS. Barres=0.2 cm

(a) Test GUS réalisé sur les cals pSHR1:GUS durant les étapes de régénération.

(b) Test GUS réalisé sur les cals TALEN SHR1 dans le fond pSHR1:GUS durant les étapes de régénération.

(c) Test GUS réalisé sur les cals OE SHR1 dans le fond pSHR1:GUS durant les étapes de régénération.

(d) Test GUS réalisé sur les cals pSHR1:SHR1:GFP dans le fond pSHR1:GUS durant les étapes de régénération. 0 20 40 60 80

Taux des cals initiants des organes aériens

jour 0 jour 13 jour 20 jour 28 jour 35 jour 40 61% 14% 32% 30% 38% 8%

Po

ur

cent

ag

e

d

e

cal

s

171 (a) (b) (c) (d)

pSHR1:SHR1:GFP

fond

pSHR1:GUS

contrôle

pSHR1:GUS

TALEN SHR1

fond

pSHR1:GUS

OE SHR1

fond

pSHR1:GUS

173 Pour conclure, les profils d’expression observés dans les cals transformés ne diffèrent pas de ceux observés pour les cals pSHR1:GUS. On ne peut donc pas apporter d’explications quant aux mécanismes de blocage encourus lors des étapes de régénération observés chez les lignées transgéniques. Cette expérience permet néanmoins d’affirmer que le gène OsSHR1 est incapable d’auto-activation que ce soit pendant la callogénèse ou pendant le développement de la plante.

174 Figure 17 : Schéma sur les potentielles régénérations de différentes lignées transgéniques

SHR1.

(a) Régénération observée pour cal un cal Nipponbare transformé avec pSHR1:GUS. L’expression du transcrit SHR1 est d’abord localisé au centre du cal. Le cal est ensuite transféré sur le milieu de régénération où le signal est relocalisé vers les structures secondaires et induit la formation d’embryons somatiques. L’expression de SHR1 finit par diminuer et permet l’émergence des organes feuilles et racines ce qui conduit à la formation d’une plante.

(b) Régénération observée pour cal un cal Nipponbare transformé avec pUBI:SHR1. L’expression ectopique de SHR1 empêche limite l’émergence des organes, suggérant que cette baisse d’expression soit nécessaire à la formation des organes.

(c) Régénération observée pour cal un cal Nipponbare transformé avec CRISPR/Cas9 SHR1. SHR1 et SHR2 individuellement, ne semblent pas être nécessaires à l’étape de régénération. (d) Le double mutant shr1 :shr2 nous permettra de savoir si leurs fonctions sont redondantes (pas de régénération) ou si aucun des gènes n’est nécessaire à la régénération (émergence des organes sur les cals).

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