Conclusion : OsSHR1 a une expression stable au cours du temps

Le gène OsSHR1 a un profil d’expression stable au cours du développement de la plante, de l’embryon jusqu’au stade mature. Son expression ne semble régulée ni par les hormones, ni par la lumière et ni par des stress salin ou osmotique. Néanmoins, il est possible que son activité soit contrôlée au niveau post-transcriptionnel.

156 Figure 7 : Le profil d’expression d’OsSHR1 ne varie pas en présence d’auxine, de gibbéréllines, de NPA ou PA.

(a) Le profil d’expression est révélé par une coloration GUS. Il est en similaire entre les différents milieux : milieu de croissance classique MS/2, milieu enrichi en auxine (AIA : 1 µM) milieu enrichi en GA (50µM), milieu enrichi en NPA (1µM) et milieu enrichi en PA (2 µM). (b) Coupes radiales de racines coronaires pour chacune des conditions (contrôle MS/2, AIA, GA, NPA et PA), avec un signal localisé dans la stèle pour chacune d’entre elles. Barres= 50µm. (c) Niveau d’expression du gène OsSHR1 ne semble pas être impacté par la présence d’hormone (GA, AIA, PA ou NPA) (n=2)

157 Figure 8 : Expression du gène OsSHR1 selon la concentration en hormone présente dans le milieu (http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/RXP_4002/gene-search.php).

Figure 9 : Profils d’expression d’OsSHR1 selon la photopériode. Barres=50µm

(a) Coloration GUS d’une coupe radiale de racine pOsSHR1:GUS en condition contrôle, avec alternance lumière et obscurité (12h/12h, 28°C/25°C jour/nuit, intensité lumineuse : 500μEm-2s-1, humidité relative 55%).

(b) Coloration GUS d’une coupe radiale de racine pOsSHR1:GUS sous lumière continue (28°C/25°C jour/nuit, intensité lumineuse : 500μEm-2s-1, humidité relative 55%).

(c) Coloration GUS d’une coupe radiale de racine pOsSHR1:GUS dans l’obscurité (28°C/25°C jour/nuit, humidité relative 55%).

158 Figure 10 : Profils d’expression d’OsSHR1 en réponse au mannitol et Nacl.

Comparaison entre des plantules sauvages de la variété Nipponbare et deux lignées transgéniques indépendante pour le construit pOsSHR1:GUS en réponse au mannitol (90 mM) et NaCl (90 mM). Barres= 50µm

(a) Coupe radiale de racine coronaire sur condition standard (MS/2), avec un signal GUS spécifique à la stèle.

(d) Coupe radiale de racine coronaire sur Mannitol, avec un signal GUS spécifique à la stèle. (e) Coupe radiale de racine coronaire sur NaCl, avec un signal GUS spécifique à la stèle.

159 Un contrôle post-transcriptionnel a été démontré pour AtSHR chez A.thaliana (Lee, Colinas et al. 2006). En effet, sa fonction dépend de la concentration de sa protéine et de la régulation de son mouvement (Koizumi, Hayashi et al. 2012; Koizumi, Hayashi et al. 2012). Une baisse du niveau d’expression protéique dans les cellules d’endoderme induit leur division périclinale et la formation de middle cortex. De plus, il a été démontré que l’absence de la protéine AtSHR inhibe la division périclinale initiale à l’origine de l’endoderme (Helariutta, Fukaki et al. 2000), et qu’au contraire, son expression ectopique engendre une augmentation des divisions du tissu interne et la formation de couches surnuméraires de cortex (Cui, Levesque et al. 2007; Wu, Lee et al. 2014). Les résultats obtenus suite à l’analyse des lignées surexpresseurs chez le riz (Chapitre 2) et ceux obtenus par nos collaborateurs concernant la complémentation du mutant shr-2 par les orthologues de SHR, suggèrent une conservation de fonction entre les orthologues SHR. Il est donc possible que ce mécanisme de régulation post-transcriptionnelle soit maintenu chez le riz.

Cette hypothèse pourrait être testée par l’utilisation des fusions traductionnelles déjà disponibles au laboratoire. Ces dernières pourraient être utilisées afin de mesurer le niveau de fluorescence au sein d’un tissu où sont exprimées les protéines SHR. Si ce niveau est variable au cours du développement de la plante, alors cela traduirait une régulation de l’expression de la protéine. Il serait également possible, à l’image de l’étude faite par Lee et al. sur la régulation de facteurs de transcription d’A.thaliana, de comparer les profils d’expression des ARNm (données par des analyses RNAseq ou puces à ADN) avec ceux des fusions transcriptionnelles (sans élément régulateurs) et avec ceux des traductionnelles. Si ces profils sont distincts, ce qui est le cas pour 25% des FT testés dont AtSHR, alors cela mettrait en évidence l’existence d’une régulation post-transcriptionnelle (Lee, Colinas et al. 2006). Si cette hypothèse est validée par l’une ou l’autre méthode, il serait intéressant de connaitre quel type de régulation est mise en place. Il en existe plusieurs types, dont celle effectuée par des petits ARN (miRNA), qui est à l’origine de la régulation de nombreux gènes et principalement de facteurs de transcription (Zhang, Pan et al. 2006). Pour mettre en évidence ce type de régulation, il serait intéressant de réaliser la construction suivante qui nécessite deux protéines rapportrices différentes : le promoteur du gène d’intérêt cloné en amont d’une première protéine rapportrice fluorescente (mCherry), suivie par la région 3’UTR d’un gène contrôle d’expression stable, suivie de la deuxième protéine rapportrice fluorescente (GFP) fusionnée au 3’UTR d’intérêt. De cette manière, la différence d’expression entre les deux protéines rapportrices devrait correspondre à une régulation différente entre les régions 3’UTR, et illustrerait ainsi les régulations subies par le gène d’intérêt étudié. Cette méthode a été mise en place puis validée sur le modèle c.elegans (Quéré 2014).

160 Figure 11 : Localisation du transcrit OsSHR1 pendant les étapes d’induction

(a) Test GUS réalisé sur un grain imbibé dans de l’eau osmosée pendant 12h, avant le passage sur le milieu d’induction. Le signal est localisé au niveau de l’embryon. Barre=0.5 cm (b) Test GUS réalisé sur le grain après une semaine sur le milieu d’induction. Le signal est localisé au niveau des faisceaux vasculaires des organes formés après germination, et dans les structures embryogènes formées au niveau du scutellum. Barre=0.2 cm. (c) Test GUS réalisé sur le grain après deux semaines sur le milieu d’induction. Le signal est localisé au niveau des structures embryogènes du scutellum. Barre=0.2 cm. (d) Test GUS réalisé sur le grain après trois semaines sur le milieu d’induction. Le signal est localisé au niveau des structures embryogènes du scutellum. Le volume du cal augmente. Barre=0.2 cm. (e) Zoom sur les structures embryogènes après trois semaines sur le milieu d’induction. Le signal se centralise. Barre=0.1cm. (f) Test GUS réalisé sur le grain après quatre semaines sur le milieu d’induction. Le signal est localisé au centre du cal. Barre=0.1cm

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II. Etude de l’expression d’OsSHR1 au cours de la callogénèse et de la