Conclusion : rôles d’OsSHR1 durant la callogénèse et la régénération

Le suivi du profil d’OsSHR1 durant la callogénèse a permis de mettre en évidence un rôle potentiel au cours des différentes étapes. En effet SHR1 est exprimé très tôt lors de la formation du cal. Sur le milieu d’induction riche en auxine, SHR1 est exprimé d’abord dans toutes les cellules, puis peu à peu son expression se relocalise au centre du cal. Lorsque le cal est transféré sur un milieu de régénération, l’expression de SHR1 s’intensifie et diffuse vers l’extérieur du cal, où se localisent les cellules en différenciation. Nous pouvons également remarquer qu’à ce stade SHR1 accompagne la différenciation des cellules jusque dans la formation des organes. L’expression de SHR1 est alors inhibée au profit des organes émergeants. L’expression du gène évolue dans le temps, et pourrait donc être impliquée dans le début du processus de formation des embryons somatiques. En particulier, l’expression de SHR1 devient nulle lors de l’émergence des organes suggérant que les défauts de régénération observés pour les surexpresseurs pourraient être dus à l’expression ectopique des homologues de SHR à un stade où elle est incompatible avec la régénération. Il existerait donc une corrélation entre l’absence de SHR et la formation d’organes lors de la régénération ; mais il est encore trop tôt pour parler de relation de cause à effet entre ces deux évènements. Il nous manque en effet des données telles que la localisation de la protéine durant ces étapes, savoir si elle est mobile et si contrairement au transcrit elle est

167 exprimée partout. Il faudrait également confirmer l’absence de SHR par le biais d’analyses moléculaires (RT-PCR, qRT-PCR).

Pour conclure, ces observations suggèrent que le gène SHR1 pourrait jouer un rôle important pendant la callogénèse. Il aurait d’abord un rôle dans le maintien des cellules souches pendant les phases d’inductions, durant lesquelles il est localisé au centre du cal. A ce stade il aurait donc un rôle semblable à celui des gènes PLT1&2 décrits dans l’introduction de ce chapitre (Kareem, Durgaprasad et al. 2015). Ensuite, après modification de son profil d’expression et la relocalisation de son transcrit vers l’extérieur du cal, SHR1 aurait un rôle dans l’initiation de la spécification des cellules en différents tissus. Enfin, la disparition de l’expression de SHR1 serait nécessaire à l’émergence ou la formation des organes lors de la régénération, en particulier des organes aériens, incluant le méristème apical. L’utilisation de lignées pINDEX:SHR1, qui permettraient d’induire l’expression de SHR1 après application de dexaméthasone sur le cal, donneraient la possibilité de vérifier que l’expression ectopique à un stade donné de SHR1 stimule l’embryogénèse somatique (verdissement des cals) et bloque l’organogénèse (émergence des organes).

L’obtention récente de mutants KO par la technologie des CRISPR/Cas9 (cf. Chap. II) nous donne des informations supplémentaires quant au fonctionnement des gènes SHR pendant la callogénèse et la régénération. En effet, nous n’avons observé aucun problème de régénération pour les deux lignées KO shr1 et shr2. Ce résultat suggère soit qu’il existe une redondance fonctionnelle entre les 2 gènes SHR et que par conséquent la présence d’un seul des gènes suffise à la régénération, ou bien qu’aucun de ces gènes ne soit nécessaire à cette étape, et que, dans le cas d’une expression ectopique de l’un d’entre eux, cela perturbe la régénération. De plus, le fait que la régénération des construits transgéniques SHR1 posent plus de problèmes que les construits SHR2 pourrait être expliqué par le fait que la protéine SHR1 est moins mobile que son paralogue. L’analyse de la régénération du double mutant shr1:shr2 permettrait de tester ces deux hypothèses. Si la régénération du double mutant est perturbée, alors cela validerait l’existence d’une redondance fonctionnelle de ces gènes durant de processus. Et au contraire, si aucun problème de régénération n’est rencontré, cela signifierait qu’aucun de ces gènes n’est essentiel à ce processus, et que leur non-expression est bien nécessaire à l’organogénèse. Ce résultat invaliderait également les hypothèses précédentes concernant les éventuelles fonctions de SHR1 durant les différentes étapes de la régénération.

La non-régénération de la lignée TALEN SHR1 reste cependant inexpliquée. La première interprétation était que l’extinction du gène empêchait la régénération, mais l’obtention de plantes KO réfute cette hypothèse. Il est néanmoins possible que ce TALEN ait affecté l’expression des deux gènes SHR ou celles d’autres gènes dans les cals, empêchant ainsi leurs régénérations. Une analyse transcriptomique des cals des différents construits (OE, KO, TALEN, et WT) permettrait d’avoir une idée des mécanismes survenant durant ce processus.

168 Figure 14 : Retard de régénération des construits dans le fond pSHR1:GUS.

pSHR1:SHR1:GFP dans fond le Nipponbare (n=14) et dans le fond pSHR1:GUS (n=35) ; TALEN SHR1 dans le fond Nipponbare (n=4) et dans le fond pSHR1:GUS (n=14) ; OE SHR1 dans fond Nipponbare (n=7), dans fond pSHR1:GUS (n=21)

(a) Photo des boites de cals après trois semaines sur le milieu de régnération : les cals transformés dans le fond pSHR1:GUS sont en retard comparé à ceux transformés dans Nipponbare. Barres=2.5cm

(b) Graphique illustrant le pourcentage de verdissement des cals pour chacun des construits pendant les 5 semaines de régénération.

0 20 40 60 80 100

Verdissement des cals sur le milieu de régnération (%)

jour 0 jour 13 jour 20 jour 28 jour 35 jour 40

(a)

(b)

169