Etat de l’art

Les nanomatériaux en général font l’objet d’un grand nombre de travaux de recherche du fait de leur découverte récente et de leurs utilisations de plus en plus massives dans de nombreux produits manufacturés. Dans le domaine de l’agroalimentaire, les nanotechnologies et les nanomatériaux sont maintenant présents partout [129] : chaine alimentaire, processus de fabrication alimentaire, emballages alimentaires, produits agricoles, etc. [130]. Les rapports publiés à ce jour ont pour but d’informer sur le fait que les nanoparticules sont des objets nouveaux et que les données concernant leurs effets potentiels sur la santé et l’environnement sont rarement répertoriés [131-140] ou lacunaires. Les trois voies d’exposition les plus courantes sont : les voies respiratoires (particules en suspension dans l’air), la voie dermique (contact) et la voie digestive (bien que l’inhalation et l’ingestion soient partiellement mécaniquement reliées).

Les NTC représentent une grande famille des nanomatériaux. Les échantillons de NTC étudiés peuvent être majoritairement monoparoi, biparois ou multiparois ; ils peuvent être synthétisés par les différentes voies décrites précédemment (voir paragraphe I.2) ; le catalyseur utilisé peut avoir une composition très variable; les NTC peuvent subir des traitements post-synthèse (purification, fonctionnalisation, mise en suspension). Il y aura donc autant de résultats de toxicité et d’écotoxicité que de types de NTC.

Il est à noter que bien souvent les NTC testés jusqu’à aujourd’hui ont été caractérisés de manière insuffisante. Ce manque de données ne permet pas de dissocier l’effet des sous-

produits de synthèse, ou de contaminants tels que les résidus de catalyseurs (métaux, oxydes), de la toxicité intrinsèque des NTC.

L’équipe NNC du CIRIMAT synthétise depuis plus de 5 ans des NTC biparois (DWNT) à partir de catalyseur Co/Mo-MgO dont un des intérêts majeur est son élimination après synthèse par un lavage à l’HCl. Le produit présente une pureté supérieure à celle de nombreux NTC commerciaux pour lesquels le support n’est pas ou mal éliminé. De plus ces DWNT sont très bien caractérisés (analyses élémentaires, DRX, neutrons, AFM, photoluminescence, spectroscopies Raman et IR, MEB, MET, MET-HR, mesures électriques sous champ, etc.), ce qui présente un atout considérable pour l’analyse et l’interprétation des expérimentations menées à l’interface avec le vivant. Les DWNT présentent l’avantage d’avoir une paroi externe qui peut être modifiée sans pour autant toucher à la paroi interne, permettant ainsi au NTC de conserver nombre de ses propriétés. Ils possèdent donc un potentiel certain pour de nombreuses applications. Ceci justifie leur étude d’un point de vue écotoxicologique.

- Toxicité

De nombreux articles ont été publiés au sujet de la toxicité des NTC. Les résultats sont, encore à l’heure actuelle, très souvent contradictoires. Plusieurs articles de revues récapitulent les résultats et les difficultés à tester ces "nouveaux" nanomatériaux [137, 138, 141-143]. Un livre répertoriant l’ensemble des travaux à ce jour aussi bien en termes de toxicité humaine que sur les animaux est paru récemment [144].

• chez l’animal :

La toxicité des SWNT a été étudiée essentiellement chez les rongeurs (souris, rats, hamsters). Les principaux effets référencés sont : mortalité [145, 146], diminution de la viabilité cellulaire [147], lésions pulmonaires [145, 148], réponses inflammatoires [148-150],

stress oxydatif [147]. Wang et al. ont observé une biodistribution dans les organes [151], et Muller et al. une biopersistance [149] des NTC. D’autres articles ne décrivent pas d’effets cytotoxiques (pas de mort cellulaire, pas d’activation des lymphocytes ni des macrophages) de SWNT fonctionnalisés chez la souris [152], ni de modification de la viabilité et de la croissance de Drosophiles en présence de SWNT [153]. Fiorito et al. [154] n’observent aucun dommage ni de mort cellulaire de macrophages humains en présence de SWNT purifiés comparativement aux effets observés en présence de particules graphitiques. Chlopek et al. [155] conservent un haut niveau de viabilité cellulaire de lignées humaines d’ostéoblastes et de fibroblastes, ainsi qu’un niveau d’ostéocalcine (hormone protéique spécifique des tissus osseux) inchangé en présence de SWNT.

En ce qui concerne les MWNT, Jia et al. [156] ont observé une cytotoxicité des macrophages alvéolaires et une inhibition de l’activité d’une enzyme mitochondriale chez le porc, ainsi qu’une altération structurale chez les organismes exposés (altération du processus d’apoptose cellulaire : altération de la membrane endothéliale et nucléique, formation de phagosomes, gonflement du réticulum endoplasmique, condensation de la chromatine). Chez la souris, Zhu et al. [157] ont démontré que des MWNT pouvaient déclencher le processus d’apoptose et endommager l’ADN. En injectant des MWNT dans le tissu sous-cutané, Sato et al. [158] ont observé chez le rat une légère inflammation qui est dépendante de la longueur des MWNT (la réponse inflammatoire est plus forte avec des MWNT longs (850 nm contre 220 nm pour les MWNT courts)) ; Koyama et al. ont observé chez la souris une irritation de la peau [159]. Des MWNT ont été testés chez des cochons d’Inde [160], les auteurs observent une inflammation cellulaire par la formation de granulomes (amas de macrophages entourés de lymphocytes) et la présence d’emphysèmes (présence de gaz dans des tissus). Ils mettent cependant en avant le fait qu’il y a des impuretés dans leurs échantillons testés et qu’ils ne peuvent pas exclure leur rôle vis-à-vis de ces différents signes d’inflammation.

Une étude préliminaire menée par Poland et al., révèle un effet pathogène de MWNT similaires à ceux de l’amiante, sur des souris [161]. Cependant, cet essai n’est réalisé que sur un petit nombre de souris et nécessite d’autres travaux.

• chez l’Homme :

Des travaux ont également été entrepris chez l’être humain à partir de cultures cellulaires (in vitro).

Au niveau respiratoire, diverses études ont pu montrer : une diminution de la viabilité cellulaire de cellules cancéreuses [162], une inhibition de la prolifération cellulaire [163], divers processus impliquant le stress oxydatif, probablement liés à la présence de résidu métallique du catalyseur [164], l’adsorption de protéines pulmonaires sur des DWNT [165].

Au niveau de la peau, ont pu être mis en évidence : une augmentation de la concentration intracellulaire de MWNT en fonction de la durée d’exposition et de leur concentration [166], une diminution de la viabilité cellulaire [166-170], une inhibition de la prolifération cellulaire [163], divers processus impliquant le stress oxydatif [171], des altérations structurales liées aux processus d’apoptose et de nécrose [165, 169], l’activation du système immunitaire à fortes doses de MWNT [168].

Sur des cultures cellulaires rénales, une diminution de la viabilité cellulaire et des altérations structurelles liées aux processus d’apoptose et de nécrose [172], ont été mises en évidence.

Sur cellules sanguines ont été observées : des altérations structurales liées aux processus d’apoptose et de nécrose [173], l’activation des monocytes humains (la réponse inflammatoire augmente avec la longueur des NTC) [158]. L’activation du système complémentaire à la fois par la voie classique (la protéine C1q s’adsorbe sur les NTC) et par la voie alternative [165] a été mise en évidence à partir du sérum du sang humain.

Les travaux de Flahaut et al. [174] n’ont pas démontré de cytotoxicité en termes de viabilité cellulaire ou d’activité métabolique sur les cellules endothéliales veineuses humaines en présence de DWNT.

Tableau I.1 : Tableau récapitulatif (non exhaustif) des travaux en toxicité humaine à partir de NTC.

Références Matériels testés Modèles cellulaires Observations Magrez et al. [162] MWNT, NF, noir de

carbone (NC) Cellules pulmonaires tumorales Diminution viabilité cellulaire Toxicité : NC > NF > MWNT Herzog et al. [163] SWNT, NC Cellules épithéliales

cancéreuses et bronchiales

Kératinocytes

Inhibition de la prolifération cellulaire

Diminution de la viabilité cellulaire Cytotoxicité : SWNT > NC Pulskamp et al.

[164] SWNT, MWNT, NC, quartz Cellules épithéliales alvéolaires Pas de toxicité aiguë (viabilité cellulaire) Pas de réponse inflammatoire Stress oxydatif (résidu catalyseur ?) Monteiro-Rivière

et al. [166]

MWNT Kératinocytes

épidermiques Localisation cytoplasmique Initiation de la réponse inflammatoire

Ding et al. [168] MWNT, MW nano- oignons

Fibroblastes de la peau et des poumons

Diminution viabilité cellulaire Augmentation du phénomène d’apoptose

Réponse inflammatoire Tian et al. [169] SWNT, charbon actif,

NC, MWNT, graphite Fibroblastes dermiques Effet de la surface : SWNT les plus cytotoxiques Diminution de la viabilité cellulaire Sayes et al. [170] SWNT Fibroblastes dermiques Effet dépendant du degré de

fonctionnalisation

Diminution de la viabilité cellulaire Manna et al. [171] SWNT Kératinocytes Stress oxydatif

Inhibition de la prolifération cellulaire

Bottini et al. [173] MWNT bruts et

fonctionnalisés Lymphocytes T Diminution de la viabilité cellulaire MWNT-f > MWNT bruts Sato et al. [158] MWNT Lignée de cellules

cancéreuses (THP-1) Réponse inflammatoire MWNT longs > MWNT courts Salvador Morales et al. [165]

SWNT, DWNT Sérum du sang Activation du système

complémentaire (inflammation) Salvador Morales

et al. [116]

DWNT Protéines alvéolaires

venant d’un lavage bronchoalvéolaire

Adsorption de protéines pulmonaires sur les DWNT

Flahaut et al. [174] DWNT Cellules endothéliales de

la veine ombilicale Pas de cytotoxicité Shvedova et al. [167] SWNT Kératinocytes épidermiques Stress oxydatif Cytotoxicité

Cui et al. [172] SWNT Cellules rénales Diminution de la capacité d’adhésion cellulaire

Apoptose

Fiorito et al. [154] SWNT Macrophages Pas de mort cellulaire Pas de dommage cellulaire

Les résultats sont donc très variés et contradictoires, certains auteurs mettant en évidence des signes de toxicité, d’autres non (Tableau I.1). Tous ces tests sont-ils adaptés aux nanomatériaux ? et aux NTC en particulier ? Ne faut-il pas développer des tests spécifiques? Il s’avère indispensable de bien caractériser les échantillons de NTC (nature des NTC, état d’agglomération, pureté…).

- Ecotoxicité

Les études concernant l’écotoxicité des NTC, c'est-à-dire leur impact sur les écosystèmes et les espèces qui les peuplent, sont beaucoup plus limitées que celles portant sur la toxicité. Pourtant, il semble raisonnable d’envisager la présence de ces NTC dans l’environnement, que cela soit lors de la production (en cas d’accident), lors de la fabrication de produits contenant des NTC, ou en fin de cycle de vie des produits commerciaux en contenant. Il est donc important et d’actualité d’étudier les risques potentiels sur l’environnement des NTC.

Les résultats publiés au sujet de l’impact environnemental des NTC sont peu nombreux, et en élargissant la recherche d’information à l’écotoxicité, quelques articles seulement s’intéressent à l’écotoxicité des fullerènes (C60).

Les travaux d’Oberdörster [175] sur des poissons (Micropterus salmoides) montrent que C60 induit du stress oxydatif au niveau du cerveau. L’étude d’autres organismes

aquatiques a été entreprise par la suite par les mêmes auteurs [176] : chez les daphnies (Daphia magna) une diminution de la reproduction est observée mais pas chez les crustacés (Hyallela azteca) ni chez les copépodes marins (harpaticoide). Les auteurs se sont aussi intéressés à deux espèces de poissons : le poisson à tête-de-boule (Pimephales promelas) chez lequel est observée une diminution de l’expression d’une protéine nécessaire au transport lipidique vers les peroxysomes en charge de la détoxification cellulaire ; contrairement au

médaka japonais (Oryzias latipes) chez lequel le niveau de cette protéine n’est pas modifié. D’autres indications sont apportées sur les daphnies et les poissons tête-de-boule par Zhu et al. [177]. Ces derniers observent une augmentation de l’expression d’une isoenzyme (intervenant dans le métabolisme oxydatif) dans le foie et l’intensification du processus de peroxydation lipidique (production de radicaux libres qui peuvent induire différentes conséquences cytotoxiques) dans le cerveau et les branchies des poissons. Les fullerènes C60

ont aussi été testés sur des poissons zèbres [178] chez qui les retards à l’éclosion et dans le développement larvaire ont été observés, ainsi qu’une diminution de la survie et du taux d’éclosion mais aussi la présence d’œdèmes. Lovern et al. [179] ont étudié deux types de préparation de suspension de C60 (avec sonication et avec un solvant éliminé par la suite, le

tétrahydrofurane (THF)) chez les daphnies (Daphnia magna). Ils observent une augmentation de la mortalité dans les deux cas, qui est cependant plus marquée en présence de C60 dispersés

avec du THF (lui-même toxique). Le mode de préparation va donc également jouer un rôle important dans l’évaluation des risques liés à l’exposition aux nanoparticules. Ces mêmes auteurs [180] affinent leurs résultats en rapportant une augmentation du rythme cardiaque des daphnies en présence de C60 (concentration étudiée : 260 ppb).

Les différents résultats répertoriés sur C60, mettent en évidence des effets écotoxiques

de ces molécules, qui sont dépendants du mode d’exposition. Ces constatations sont applicables à toutes les catégories de nanoparticules et en particulier aux NTC.

• Etudes de l’écotoxicité des NTC au niveau aquatique

Templeton et al. [181] ont étudié les effets de SWNT purifiés et oxydés (défauts de surface, présence de fonctions hydroxyles et carboxyliques) produits par arc électrique chez des crustacés (copépodes, Amphiascus tenuiremis). Les crustacés sont exposés à différentes concentrations de SWNT (0,58 - 0 ,97 - 1,6 et 10 mg/L) avec un renouvellement des milieux

tous les 4 jours pendant 28 à 35 jours. A 10 mg/L, l’augmentation de la mortalité ainsi que la diminution de la reproduction sont significatives.

Des SWNT commerciaux (HiPco, Carbon Nanotechnologies) sont stabilisés en les combinant avec un phospholipide amphiphile, la lysophosphatidylcholine (LPC) [127]. Cette suspension est stable pendant plusieurs mois. Différentes concentrations en NTC (0,1 – 0,25 – 0,5 – 1 – 2,5 – 5 – 10 et 20 mg/L) sont testées chez des daphnies (Daphnia magna) pendant 96 heures. A 10 mg/L, 20 % de mortalité sont observés chez les crustacés. Pour une concentration de 20 mg/L, 100 % de mortalité sont démontrés. La présence des animaux et de la nourriture interagit avec le milieu et favorise la sédimentation de la suspension de SWNT-LPC (quelle que soit la concentration en NTC). Le temps à partir duquel la sédimentation est observée n’est pas précisé.

D’autres SWNT commerciaux (Cheap Tubes Inc.) sont testés chez des truites (Oncorhynchus mykiss) [182]. Ils sont stabilisés par du sodium dodécylsulfate (SDS) à différentes concentrations selon la concentration de NTC à stabiliser (0,1 – 0,25 et 0,5 mg/L). Après 10 jours d’exposition aux SWNT, des pathologies respiratoires sont observées chez les truites exposées : augmentation du taux de ventilation, pathologies branchiales et sécrétion de mucus dans lequel les NTC ont précipité. Ces phénomènes sont "dose-dépendants". Il est cependant très important de noter que le tensioactif utilisé engendre également des effets néfastes observés chez les témoins non exposés aux NTC. Il est donc litigieux d’attribuer les effets observés uniquement aux SWNT. De plus, lors de ces essais les truites ne sont pas nourries pour éviter une adsorption de la nourriture et des excréments sur les NTC ainsi que pour maintenir la qualité de l’eau pendant la durée des tests.

Des études comparatives ont été réalisées chez le poisson zèbre (Danio rerio) sur deux types de NTC : des SWNT commerciaux (Sigma Aldrich, concentrations testées : 20 – 40 – 60 – 120 – 240 et 360 mg/L) et des DWNT synthétisés par CCVD [56] (120 et 240 mg/L)

[183]. Les essais ont été réalisés sur des embryons de poissons zèbres sur les 96 heures suivant la fertilisation. Dans le cas des SWNT, un retard à l’éclosion est observé (entre 52 et 72 heures) aux concentrations supérieures à 120 mg/L mais 99 % des embryons ont éclos à 75 heures. Il est probable que ce retard soit lié au cobalt et au nickel qui sont des produits résiduels de la synthèse des SWNT utilisés dans cette étude. Le chorion des embryons est une barrière protectrice contre les NTC car ces derniers sont regroupés en agglomérats micrométriques alors que les pores du chorion sont nanométriques. Les DWNT induisent aussi un retard à l’éclosion mais à partir de 240 mg/L. Ces retards à l’éclosion n’induisent pas de modifications morphologiques ou génétiques dans le sens où après éclosion les animaux exposés ou non aux NTC sont indiscernables.

Le tableau I.2 présente un récapitulatif des résultats obtenus par les différents auteurs au niveau du milieu aquatique, en précisant la concentration à partir de laquelle une toxicité est observée en fonction de chaque espèce (LOEC = Lowest Observed Effect Concentrations).

Tableau I.2. : Tableau récapitulatif des résultats d’écotoxicité sur organismes aquatiques en présence de NTC.

Espèces aquatiques

étudiées Types de NTC LOEC (mg/L) Références

Copépode, Amphiascus tenuiremis SWNT 10 Templeton et al. [181] Daphnie, Daphnia magna SWNT + LPC 10 Roberts et al. [127] Truite, Oncorhynchus mykiss SWNT + SDS 0,1 Smith et al. [182] SWNT 120 Poisson zèbre, Danio rerio DWNT 240 Cheng et al. [183]

• Etudes de l’écotoxicité des NTC dans le sol et chez les plantes :

Petersen et al. ont étudié les effets de MWNT et SWNT (marqués au 14C) sur des vers de terre (Eisenia foetida) [184] et des lombrics (Lumbriculus variegatus) [185]. Les NTC ont été détectés dans l’intestin mais aucune translocation dans les tissus n’a été démontrée.

Une étude chez des plantes supérieures (radis, colza, ivraie, laitue, blé, concombre, maïs) [186] exposées à des MWNT (de 20 à 2000 mg/L) ne montre aucun effet au niveau de la germination des graines et de la croissance racinaire.

Dans le cadre de cette thèse nous nous limiterons à l’étude de l’impact environnemental des DWNT bruts, purifiés et fonctionnalisés par oxydation à l’acide nitrique. En effet, la purification et la fonctionnalisation des NTC modifient souvent fortement le comportement physico-chimique des échantillons. La purification élimine généralement en grande partie les espèces contaminantes des échantillons. Il est donc probable que les échantillons de NTC bruts et de NTC purifiés n’interagissent pas de la même manière avec leur environnement. La fonctionnalisation modifiant les propriétés de surface des NTC, il est compréhensible que les résultats en termes de toxicité et d’écotoxicité soient différents pour les différents types de NTC. Magrez et al. [162] observent une toxicité plus importante sur des lignées cellulaires pulmonaires tumorales humaines lorsque les MWNT sont fonctionnalisés. Les réponses potentiellement toxiques des NTC peuvent aussi dépendre de la nature de la fonctionnalisation du NTC ainsi que du degré de fonctionnalisation [170]. Cependant, Dumortier et al. [152] n’ont pas mis en évidence de cytotoxicité à partir de NTC fonctionnalisés. Dans le cas de l’étude sur l’écotoxicité des DWNT nous étudierons les effets des deux voies de fonctionnalisation (covalente et non-covalente) ainsi que la purification sous air.