Nous commen¸cons par passer en revue le syst`eme exp´erimental, les dispositifs `a ondes acous- tiques de surface et les protocoles cellulaires utilis´es.
5.2.1 Dispositif et proc´edure exp´erimentaux
Les exp´eriences ont ´et´e r´ealis´ees sur des cellules (en pointill´es rouges sur la figure5.2) adh´er´ees `
a la surface du niobate de lithium (LiNbO3) et immerg´ees dans une goutte de 20 µL de tampon phosphate salin (PBS). Les ondes de Rayleigh sont g´en´er´ees par l’application d’un signal si- nuso¨ıdal aux peignes interdigit´es (PI). L’excitation est assur´ee par un g´en´erateur radiofr´equence (Agilent, mod`ele N9310a) suppl´e´e par un amplificateur (Empower, model BBM0D3FEL) afin d’atteindre une puissance ´electrique de l’ordre du watt.
SAW Peignes
Substrat de niobate de lithium Couche cellulaire Gou8e de PBS Microscope à contraste de phase Caméra Générateur RF 17,1 MHz Amplificateur + 28 dB
Figure 5.2: Sch´ema du dispositif exp´erimental.
Une zone de travail (emplacement de goutte) de 8×8 mm2 est d´elimit´ee par des marqueurs `a la surface du substrat. L’´echantillon est plac´e sous un microscope `a contraste de phase (Motic, model AE 30/31) ´equip´e d’un objectif poss´edant un rapport de grossissement de 10, pour zoomer sur la couche cellulaire (la zone d’observation ´etant de 2 mm de diam`etre). Le d´ecollement cellulaire est enregistr´e par une cam´era ”normale” (25 fps, Guppy F-146B) pour les exp´eriences pr´eliminaires et une cam´era rapide (1000 fps,10 bits CMOS, PCO, model pco.1200hs) par la suite. Un test de survie `a court terme est effectu´e `a la fin de chaque exp´erience par l’utilisation
ImageJ. Les deux types cellulaires sont distingu´es grˆace `a leur diff´erence de caract´eristiques morphologiques (figure 5.3).
100 µm
Figure 5.3: Photographie de co-adh´esion des deux lign´ees cellulaires (A7r5 et HEK 293) apr`es incubation dans une solution de cellules resuspendues. Les fl`eches permettent de mettre en
´evidence deux specimens typiques de cellules.
5.2.2 Dispositifs `a ondes acoustiques de surface
Dans un premier temps, les exp´eriences exploratoires ont ´et´e r´ealis´ees en utilisant des dispositifs classiques ayant une fr´equence de r´esonance de 23 MHz.
Puis pour la seconde phase de l’´etude, une nouvelle g´en´eration de dispositifs a ´et´e fabriqu´ee. Les ondes acoustiques, pour ces nouveaux dispositifs, se propagent dans une seule direction `a une fr´equence de 17,1 MHz grˆace `a l’utilisation d’un design de type EWC-SPUDT (Electrode Width Controlled Single-Phase Unidirectionnal Transducers) [121] pour les peignes interdigit´es. Le substrat piezo´electrique utilis´e est du niobate de lithium d’un millim`etre d’´epaisseur en coupe X (Newlight Photonics). La direction de propagation des ondes est orient´ee selon l’axe cristallographique Z afin d’obtenir un meilleur coefficient de couplage ´electrom´ecanique (Kz = 4.9 %).
La microfabrication des substrats est r´ealis´ee suivant un proc´ed´e liftoff de photolithographie. Une ´epaisseur de 2µm d’une r´esine photosensible positive (Shipley S18-13, Microchem) est ´etal´ee sur la surface du LiNbO3par enduction centrifuge. Les motifs des marqueurs de la zone de travail et des ´electrodes sont reproduits dans la r´esine par une insolation suivie d’une r´ev´elation. Une couche de 20 nm de titane (couche d’accroche) et de 200 nm d’or (couche conductrice) est d´epos´ee par ´evaporation sous vide. Finalement, cette couche est retir´ee de la zone non insol´ee par un bain d’ac´etone (proc´ed´e liftoff) r´ev´elant seulement les motifs voulus.
5.2.3 Pr´eparation cellulaire
Deux lign´ees cellulaires ont ´et´e utilis´ees pour ces exp´eriences : les cellules r´enales embryonnaires humaines HEK-293 et les cellules musculaires lisses aortiques de rat A7r5. Ces deux types cellu- laires pr´esentent l’avantage d’ˆetre facilement cultivables et ont des forces d’adh´esion comparables aux cellules normales [256] et canc´ereuses [257]. Cependant, l’adh´esion d’une cellule est sensible `
a la composition et `a la pr´eparation de la surface en raison de la complexit´e des m´ecanismes sous-jacents (s´ecr´etion de prot´eines d’adh´esion). Pour les exp´eriences pr´eliminaires, nous avons utilis´e des ´echantillons recouverts d’or. Cependant la surface se d´egradant rapidement (rayures pendant la phase de nettoyage), nous avons choisi, pour la seconde g´en´eration de dispositif, de fair adh´erer les cellules directement sur le substrat de LiNbO3. L’adh´esion sur ces deux surfaces est diff´erente [258] et les r´esultats entre ces deux ´etudes ne seront donc pas compar´es. Le choix du LiNbO3, mat´eriau commun´ement utilis´e pour g´en´erer des ondes acoustiques de surface, nous permet de d´efinir un point de r´ef´erence. De plus, le substrat pourra, si n´ecessaire, ˆetre fonction- nalis´e par un traitement de surface sp´ecifique d´edi´e `a l’adh´esion cellulaire [259,260]. Les cellules adh`erent `a la surface, soit directement pendant la phase de croissance pour les exp´eriences avec une seule lign´ee, soit par incubation du dispositif dans une solution de cellules resuspendues apr`es culture pour les exp´eriences avec une ou deux lign´ees.
Les cellules A7r5 et HEK 293 sont cultiv´ees s´epar´ement dans des boˆıtes de P´etri de 60 mm contenant un milieu de culture (DMEM suppl´e´e par 10% de s´erum de foetus bovin inactiv´e par chauffage, 2 mM de L-glutamine, 50 IU/mL de p´enicilline, 50 µg/mL de streptomycin, Wisent). Elles sont incub´ees sous une atmosph`ere contrˆol´ee en dioxyde de carbone (5 %) `a 37˚C pendant 24h `a 48h. Pour les exp´eriences o`u l’adh´esion est obtenue pendant la croissance des cellules, le substrat de LiNbO3 est plac´e au fond de la boˆıte de Petri durant la phase de culture.
Pour les autres exp´eriences, les solutions de cellules resuspendues pour le d´ecollement sont pr´epar´ees par le protocole suivant : rin¸cage des cellules dans du PBS apr`es 24h de culture ; incubation dans 500 µL de trypsin-EDTA pendant 5 min `a 37˚C pour casser les liaisons cellules- boˆıtes de P´etri et cellules-cellules ; resuspension dans 2 mL de milieu de culture afin de stopper la digestion de la trypsin ; centrifugation pendant 5 min pour pouvoir s´eparer les cellules de la solution ; resuspension dans une solution saline tap´ee par HEPES (HBSS) (20 mM Hepes `a pH 7.4, 120 mM de NaCl, 5.3 mM de KCl, 0.8 mM de MgSO4, 1.8 mM de CaCl2, and 11.1 mM de dextrose). Les solutions pour le tri sont, elles, pr´epar´ees en combinant les solutions d’HEK 293 et d’A7r5 resuspendues dans des proportions d´etermin´ees exp´erimentalement pour atteindre un nombre de cellules ´equivalent de chaque lign´ee dans la solution finale. Enfin, les substrats de Niobate sont plac´es dans une boˆıte de Petri, immerg´es dans la solution de cellules resuspendues et incub´es `a 37˚C pendant un temps variable (15 `a 90 min). Ce protocole a ´et´e mis en place par Yannick Miron (technicien cellulaire de l’institut de pharmacologie de l’Universit´e
la croissance des cellules et il est alors possible de r´ealiser plusieurs exp´eriences par jour sur le mˆeme dispositif (une culture dure de 24h `a 48h), acc´el´erant drastiquement l’´etude. De plus, nous pouvons ainsi ”contrˆoler” l’adh´esion cellulaire grˆace `a la variation du temps d’incubation.
Le substrat, apr`es la phase d’adh´esion, est rinc´e dans du PBS. Les cellules en dehors de la zone de travail sont s´ech´ees et retir´ees m´ecaniquement, laissant une couche cellulaire adh´er´ee de 8×8 mm2 recouverte par un film mince de PBS. Une goutte de 20 µL de PBS est ajout´ee sur cette zone. Il est int´eressant de remarquer que la surface de travail, en raison de la s´ecr´etion des cellules adh´er´ees, devient fortement hydrophile ; le liquide s’´etale sur la zone carr´ee avec un angle de contact important.