L’isolement d’un type de cellule `a partir d’un ´echantillon h´et´erog`ene tel que le sang est une ´
etape fondamentale pour une large gamme d’applications. En effet, les cellules, une fois isol´ees, peuvent ˆetre analys´ees `a des fins m´edicales (diagnostic) ou ˆetre exploit´ees, grˆace `a une mise en culture, pour la th´erapie cellulaire [219], les biotechnologies [220], la recherche m´edicale ou encore la biologie cellulaire. Cette vari´et´e d’applications a conduit `a l’´elaboration de techniques de tri cellulaire modulables qui font, `a l’heure actuelle, office de standard.
5.1.1 M´ethodes conventionnelles de tri
Trois techniques de tri sont largement utilis´ees dans les hˆopitaux et laboratoires de recherches. Le tri par centrifugation [221], m´ethode la plus ancienne, exploite la diff´erence de masse et de taille entre les cellules pour les s´eparer. Cette m´ethode pr´esente l’avantage d’ˆetre simple et rapide mais peut modifier le ph´enotype des cellules par l’application d’une excitation intense (plusieurs centaines de g) et la r´ecup´eration des diff´erents types cellulaires fait appel `a un certain savoir-faire. De plus, cette m´ethode n’est applicable que pour des cellules avec des coefficients de s´edimentation (d´ependant de la taille et de la masse) diff´erents.
Dans les ann´ees 1940, une nouvelle technique d’analyse des propri´et´es cellulaires bas´ee sur la lumi`ere diffus´ee par une cellule passant au sein d’un faisceau laser voit le jour : la cytom´etrie en flux [222]. Cette m´ethode permet une ´etude quantitative (une seule cellule est analys´ee `a la fois) et qualitative (diffusion d´ependant de la taille et de la constitution de la cellule) d’un ´
echantillon biologique h´et´erog`ene. L’encapsulation d’une cellule dans une goutte charg´ee selon le r´esultat de l’analyse permet alors de trier les cellules grˆace `a la d´eflexion impos´ee par un champ ´electrique ext´erieur lors de la chute de ces gouttes (figure5.1). Cette m´ethode, connue sous le nom de tri activ´e par fluorescence (FACS) [223], s’´etend alors `a une vari´et´e d’application grˆace aux marquages des cellules par des fluorochromes (d´etection par fluorescence) par des ligands sp´ecifiques. Cette technique rapide (plusieurs milliers de cellules par seconde), efficace (d´etection multi-param`etres) et modulable (grˆace aux marquages) devient alors le standard du tri cellulaire. Cependant la complexit´e du syst`eme de mesure et de tri la rend on´ereuse.
La tri cellulaire magn´etique (MACS) [224], bas´e sur le marquage des cellules par des micro- ou nanoparticules magn´etiques permet de s’affranchir de cette m´ethode de d´etection et de tri. La suspension cellulaire est introduite dans une colonne plac´ee dans un aimant. Les cellules marqu´ees sont retenues dans la colonne alors que le cellules non marqu´ees sont ´elu´ees dans un premier r´ecipient. En retirant le champ magn´etique, les cellules marqu´ees sont ´evacu´ees dans un second r´ecipient. Cette m´ethode est donc moins on´ereuse, bien que la consommation en nanoparticules adapt´ees repr´esente un coˆut non n´egligeable.
Figure 5.1: Principe de fonctionnement du tri activ´e par fluorescence [223].
Ces trois techniques utilis´ees `a tour de rˆole, ou ind´ependamment, permettent alors de couvrir une large gamme de types cellulaires et d’efficacit´e. Cependant, avec l’avanc´ee de la recherche m´edicale, des applications nouvelles comme la th´erapie cellulaire [219] ou la reprogrammation de cellules souches [225] requi`erent un tri cellulaire limitant le stress cellulaire. Le marquage ou la centrifugation rendent ces m´ethodes conventionnelles inadapt´ees pour ces applications.
5.1.2 Tri microfluidique
Les plateformes microfluidiques permettent d’apporter des solutions `a ces nouveaux challenges [226]. En effet, grˆace `a leur aptitude `a travailler `a l’´echelle cellulaire, les LSP ouvrent la porte `
a une multitude de techniques de tri cellulaire dites ”sans marquage” [227]. Nous pouvons no- tamment citer le filtrage hydrodynamique [228] ou le d´eplacement lat´eral d´eterministe [229] bas´e sur la taille, la dielectrophor`ese [230,231], les pinces optiques [232,233], le tri par raideur [234, 235], l’acoustophor`ese [77,236] et le tri par diff´erence d’adh´esion cellulaire [237–239] tel que celui d´evelopp´e au sein de cette ´etude. L’utilisation de ces techniques reste encore limit´ee en raison des faibles diff´erences de propri´et´es intrins`eques (faible modulabilit´e) et `a leur relative nouveaut´e. Cependant, la distinction de pouvoir d’adh´esion entre deux cellules peut ˆetre am- plifi´ee par une nanostructuration [238] de surface, ou une biofonctionnalisation [239] (traitement de la surface avec des prot´eines d’adh´esion sp´ecifiques) faisant du tri par adh´esion un candidat prometteur.
5.1.3 D´ecollement cellulaire
une culture cellulaire g´en´eralement r´ealis´ee dans une boˆıte de P´etri. Un d´ecollement des cellules de la surface de culture est donc n´ecessaire pour les r´ecolter. Traditionnellement, celui-ci est effectu´e par l’utilisation de Trypsin-EDTA [240] qui dig`ere les prot´eines d’adh´esion et rompt alors les liaisons de la cellule. Cette m´ethode peut s’av´erer agressive pour les cellules et n´ecessite une ´etape de rin¸cage. Une technique alternative consiste `a soumettre les cellules adh´er´ees `a un ´
ecoulement cisaillant. L’efficacit´e de cette m´ethode a ´et´e prouv´ee par l’utilisation d’un disque rotatif [241] et plus r´ecemment via un ´ecoulement en microcanal [242] aliment´e par une pompe ext´erieure ou des ondes acoustiques de surface [54, 55]. Dans un contexte de laboratoire sur puce, il est int´eressant d’int´egrer cette ´etape pour la r´ecolte des cellules apr`es culture [243] ou pour le nettoyage de surface.
5.1.4 Microfluidique digitale
Le tri et le d´ecollement cellulaire en microfluidique en microcanaux [244, 245] ont connu un d´eveloppement rapide ces derni`eres ann´ees, mais restent peu ´etudi´es en microfluidique en goutte, bas´ee sur une physique compl`etement distincte. La microfluidique digitale (en goutte) (MDF) permet de r´eduire les volumes utilis´es [246], et est plus adapt´ee pour l’´etude des propri´et´es d’une petite population de cellules, par exemple pour l’investigation des m´ecanismes complexes d’adh´esion cellulaire qui suscitent un vaste int´erˆet [247,248]. Cette r´eduction de volume restreint ou rend inexploitables les effets d´evelopp´es en g´eom´etrie ferm´ee. Cependant, l’exploitation de ph´enom`enes propres `a la MDF tels que la d´eformation de la surface libre peut cr´eer, voire am´eliorer, certaines fonctions. L’activation de liquide en MFD est g´en´eralement r´ealis´ee par des ondes acoustiques de surface (SAW) [19,35], ´electromouillage [249], ou di´electrophor`ese [250]. Cette derni`ere a d’ailleurs ´et´e utilis´ee dans la premi`ere ´etude de tri cellulaire en goutte [251]. Une adaptation du tri cellulaire magn´etique a ensuite ´et´e utilis´ee pour la seconde ´etude de tri [252]. Le tri par adh´esion, quant `a lui, n’a pas encore ´et´e ´etudi´e en MFD en raison des faibles forces g´en´er´ees par l’´electromouillage et de la sensibilit´e des membranes cellulaires aux excitations di´electrophor`eses intenses [253, 254]. Les ondes acoustiques de surface peuvent r´epondre `a ce manque. En effet, grˆace aux ´ecoulements cr´e´es par ”vent” acoustique, il est possible d’imposer un cisaillement suffisant pour d´etacher une couche cellulaire en microcanaux [54, 55]. Cependant, en goutte ces ´ecoulements sont limit´es par le confinement, la restriction de puissance acoustique impos´ee par l’´evaporation, et le d´eplacement de goutte. L’objectif de ce travail a donc ´et´e de surmonter ces contraintes afin de d´ecoller et trier des cellules adh´erant `a la surface de contact d’une goutte sessile.
Au vu de la complexit´e des ´ecoulements se d´eveloppant au sein d’une goutte soumise `a des ondes acoustiques de surface, cette ´etude se d´ecompose en deux phases. Dans un premier temps nous avons explor´e le potentiel d’un tel syst`eme `a d´ecoller un type cellulaire. Pour ce faire, nous avons test´e une gamme de puissances, diff´erents ´etats d’adh´esion de la couche cellulaire et plusieurs
types d’excitations. Ce travail pr´eliminaire [255] a permis de mettre en exergue l’efficacit´e des signaux modul´es, en comparaison d’une excitation continue, pour d´ecoller des cellules. Dans un second temps, nous avons cherch´e `a comprendre l’origine hydrodynamique de cette am´elioration pour exploiter et optimiser ce ph´enom`ene. Puis nous avons test´e l’efficacit´e de cette m´ethode pour trier deux types de cellules.