Dans l’objectif d’un traitement in vivo de tumeurs il est important de prendre en compte un paramètre supplémentaire lors qui est le temps de contact entre le PAM et le sphéroïde. Lors des précédentes mesures, le sphéroïde est placé soit 4 h en contact avec le PAM pour l’observation des dommages à l’ADN (le temps de contact a été fixé à 4 h pour effectuer la mesure avant le détachement des cellules) ou en continu dans le cas des suivis de volume sur 9 jours.
Dans le cas in vivo, la durée de résidence d’un médicament dans la zone d’injection est limitée dans le temps (très probablement inférieure à la demi-heure). De plus, la diffusion lente rend difficile la modélisation correcte de ce paramètre. Pour pouvoir estimer le potentiel d’un traitement par PAM nous avons choisi de fixer un temps de contact court de 10 min pour se rapprocher des conditions réelles d’un traitement in vivo.
À partir des marquages immunofluorescents des dommages à l’ADN dans les deux condi- tions de temps de contact, nous avons pu observer un profil de fluorescence de γ-H2AX issu des coupes cryogéniques représentées figure 6.11.1. Sur cette figure, on observe tout d’abord une légère différence de diamètre entre les deux conditions imputable, soit à une petite variations de taille des sphéroïdes avant traitement, soit à la position des coupes dans le sphéroïde, du fait que les sphéroïdes ne sont pas toujours parfaitement rond ce qui induit une légère différence des coupes.
On observe tout d’abord une fluorescence aux extrémités du profil concordant avec la répartition sur les couches périphériques du sphéroïde des cellules présentant des dommages à l’ADN. On observe également que l’intensité de fluorescence est bien plus élevée dans le cas d’un temps de contact de 4 h avec une valeur de l’ordre de 250 alors qu’elle n’est que de 50 pour un temps de contact de 10 min. La quantité de dommage à l’ADN ,directement déduite par l’intensité de fluorescence, est donc proportionnelle au temps de contact. Il est à noter également que contrairement à l’intensité, la répartition des dommages est similaires avec une trentaine de micromètres d’épaisseur dans les deux cas.
Nous avions émis l’hypothèse dans des sections précédentes que le taux de dommage à l’ADN était proportionnel à la concentration de peroxyde d’hydrogène dans le milieu activé par plasma et que la pénétration était limitée par un gradient de pression à l’intérieur du sphéroïde. Par conséquent, le PAM ayant été exposé 120 s (pour les deux cas de temps de contact) et que le temps de transfert est le même dans les deux cas (10 min), les sphéroïdes se retrouvent en contact avec la même concentration de peroxyde d’hydrogène ce qui conduit à une même pénétration.
L’analyse des dommages à l’ADN indique que le traitement de courte durée induit peu de dommages ce qui peut être problématique lors d’une campagne de traitement in vivo. Si l’on observe sur la figure 6.11.2 l’évolution de volume des deux conditions sur les neufs
Figure 6.11.1 – Profil de fluorescence des dommages à l’ADN dans le cas d’un temps de contact court avec le PAM (10 minutes) représentatif d’un traitement in
vivo et contact long (4 heures). Conditions expérimentales : Texp = 120 s,
Ttrans = 10 min.
jours suivants le traitement, on observe distinctement deux processus différents en fonction du temps de contact.
Dans le cas d’un temps de contact classique de neuf jours, on observe une première dimi- nution rapide du ratio T/C au premier jours après traitement. Cet effet est imputable au détachement des cellules en périphérie du sphéroïde suite à des dommages à l’ADN impor- tants (vitesse de croissance négative : -1.61x107µm3/jour). Ensuite, du jour 1 à 9 le ratio
T/C est constant traduisant une reprise de croissance faible des cellules de 0.95x107µm3/jour
comparer aux 2.88x107µm3/jour des contrôles. Cette inhibition de croissance est causée par
au moins une espèce présente dans le PAM car si le milieu de culture est remplacé par du mi- lieu non traité au bout de 4 h de contact, le détachement initial est identique mais la reprise de croissance du jour 1 à 9 est bien plus élevée avec une valeur proche de 2.1x107µm3/jour1.
En ce qui concerne le temps de contact court de 10 min, deux phases sont également observées. La première est une baisse du ratio T/C entre les jours 0 et 6 jusqu’à atteindre un ratio de 0.4. Cette baisse du ratio représente une diminution drastique de la vitesse de croissance des sphéroïdes ayant était traités par PAM (0.78x107µm3/jour). Après le jour
6 et jusqu’à la fin de nos mesures, ce ratio croît doucement pour atteindre au jour 9 une valeur de 0.5. Cette augmentation du ratio correspond à une vitesse de croissance d’environ 1.86x107µm3/jour.
1. NB : contrairement aux précédentes mesures réalisées à 120 s d’exposition au jet d’hélium, l’inhibition de croissance obtenue lors de ces mesures est plus importante passant de 0.6 à 0.4. Cette modification des résultats est causée par le changement du fournisseur du milieu de culture.
Lors d’un traitement avec temps de contact court, l’hypothèse la plus vraisemblable est que les dommages à l’ADN ne sont plus suffisants pour induire la mort des cellules atta- quées. En effet, aucun détachement n’est observé mais la vitesse de prolifération est réduite d’un facteur 3 par rapport au contrôle. Il est donc envisageable que dans ces conditions de traitement les cellules limitent leurs proliférations au profit d’une réparation des dommages à l’ADN. Une fois les réparations effectué les cellules reprennent une vitesse de croissance plus élevée puisqu’elles sont dans un milieu neuf (non activé par plasma) contenant tout les facteurs de croissance essentiels.
Par conséquent lors de campagne de mesure in vivo il est essentiel de réaliser plusieurs traitements à minima 1 fois tout les 6 jours avant la reprise de croissance des cellules can- céreuses. Cette méthode de traitement répétitif à déjà fait l’objet de publication lors du traitement direct de cellules cancéreuses in vivo par jet de plasma [156, 158] et également par PAM [134, 157]. Dans ce dernier cas de figure le traitement par PAM a été débuté le len- demain de l’injection sous la peau d’un modèle murin de cellules cancéreuses en suspension dans un gel. Le protocole ne permet pas d’identifier clairement si les effets d’un traitement par PAM sont liés au traitement des cellules avant la formation de tumeur ou après.
Figure 6.11.2 – Influence du temps de contact (10 minutes et 9 jours) sur la croissance des sphéroïdes HCT116 suite à un traitement par PAM.